Разработка методов выявления генома энтеровируса и парвовирусов КРС

• Автор: Кочетков, Сергей Андреевич
• Шифр специальности: 03.02.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Владимир
• Количество страниц: 120 с. : ил.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
а.о. — аминокислотный остаток;
ВКО - внутренний контрольный образец;
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота; кДНК - копия с РНК матрицы;
КРС - крупный рогатый скот; мРНК - матричная РНК;
НК — нуклеиновая кислота;
НТО — нетранслируемая область генома;
ОРС - открытая рамка считывания;
ОТ - обратная транскрипция;
ПААГ - полиакриламидный гель; п.н. - пар нуклеотидов;
ПВ - парвовирус;
ПЦР - полимеразная ценная реакция;
РНК - рибонуклеиновая кислота;
ФБР - фосфатно-буферный раствор;
ЭВ - энтеровирус;
ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота; AAV - адено-ассоциированные вирусы;
BEV - Bovine enterovirus;
BPV - Bovine parvovirus;
dNTP - дезоксинуклеотидтрифосфаты.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Характеристика семейства Picornaviridae
1.2. Основные свойства энтеровирусов
1.2.1. Строение вириона
1.2.2. Физико-химические свойства энтеровируса КРС
1.2.3. Структура и организация генома
1.2.4. Вирусные протеины
1.2.5. Репликация
1.2.6. Антигенные свойства вируса и иммунитет при энтеровирусной инфекции
1.2.7. Эпизоотологические данные
1.2.8. Клинические признаки и патологоанатомические изменения
1.3. Характеристика семейства Parvoviridae
1.4. Основные свойства парвовирусов
1.4.1. Строение вириона
1.4.2. Физико-химические свойства
1.4.3. Структура и организация генома
1.4.4. Вирусные протеины
1.4.5. Репликация парвовирусов
1.4.6. Антигенные свойства
1.4.7. Эпизоотологические данные
1.4.8. Клинические признаки и патологоанатомические изменения
1.5. Диагноз и дифференциальный диагноз энтеровируса и парвовирусов КРС

1.6. Заключение по обзору литературы
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Материалы
2.1.1. Биологические материалы
2.1.2. Объект исследования
2.1.3. Химические реагенты
2.1.4. Растворы, буферные смеси и ферменты
2.1.5. Праймеры
2.1.6. Оборудование
2.2. Методы
2.2.1. Подбор праймеров и компьютерный анализ
2.2.2. Отбор проб
2.2.3. Выделение суммарной нуклеиновой кислоты (ДНК, РНК)
2.2.4. Обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция
2.2.5. Электрофорез в агарозном геле
2.2.6. Очистка продуктов ПЦР
2.2.7. Секвенирование амплифицированных фрагментов

2.2.8. Расчёт эпизоотологических показателей и статистическая обработка данных
3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Разработка метода ОТ ПЦР для выявления генома энтеровируса КРС с использованием внутреннего контрольного образца
3.1.1. Анализ нуклеотидных последовательностей энтеровируса КРС
3.1.2. Выбор первичной структуры праймеров
3.1.3. Оптимизация условий постановки ОТ ПЦР

Таблица
Структура праймеров для амплификации фрагмента генома парвовируса КРС 3, предложенных АНапйег Т. с соавторами
Наименование Первичная структура праймеров Локализация праймеров
BPV-3 capsid Fl* 5'- CGG ЛАС CGC TAA GGC АТС AG -3' 4411-4430
BPV-3 capsid RI* 5'- ACT GGT GCA GGT AAT GCT CTG А -3' 4808-4829
BPV-3 capsid F2** 5'- AG С GAC CAG CAT TGG GTG GAT -3' 4692-4712
BPV-3 capsid R2** 5'- GGT GCA GGT AAT GCT CTG AG -3' 4807-4826
* FI/Rl - амплис шкация
** F2/R2 - реамплификация
2.1.6. Оборудование
В процессе выполнения работы было использовано следующее оборудование:
- ПЦР-бокс с встроенным ультрафиолетовым облучателем (“C.B.S. SCIENTEFIC СО.”);
- холодильник «Ока-6М-206» (Россия);
- низкотемпературный холодильник на минус 70°С (Nuaire);
- автоматический секвснатор (Applied Biosystems);
- программируемые амплификаторы РТС-100 и Mini Cycler (M.J. Research, Inc.);
- комплект приборов для проведения горизонтального электрофореза (EASY CAST Electrophoresis system);
- аппарат для для получения деионизованной воды Milli-Q (Millipore);
- термостат, программируемый для пробирок, поддерживающий температуру 37 °С и выше (ООО «Компания Биоком»);
- микроцентрифуга для пробирок (Elmi);
- вакуумный насос (Millipore) с приёмной ёмкостью;
- источник питания VWR-105 (VWR Scientific Company);
- вортекс (ООО «Компания Биоком»);