Синтез полиэфиров гидроксипроизводных жирных кислот (полигидроксиалканоатов) и характеристика состава липидов сине-зеленых, светящихся и водородокисляющих прокариот

• Автор: Калачева, Галина Сергеевна
• Шифр специальности: 03.01.06
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Красноярск
• Количество страниц: 71 с.; 19х14 см.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Многообразие форм живой материи и новые знания в области физики и химии живых систем позволяют конструировать биологические системы различной степени сложности и организации для синтеза широчайшего спектра макромолекул. Ценным продуктом биотехнологии являются резервные соединения липидной природы - полимеры гидроксипроизводных жирных кислот (полигидроксиалканоаты, ПГА), которые обладают широким спектром ценных свойств, включая биосовместимость и биоразрушаемость, и перспективны для различных сфер применения (Anderson, Dawes, 1990; Madison, Huisman, 1999; Steinbüchel, Lütke-Everson, 2003; Chen, 2010; Волова, Шишацкая, 2011).
Микроорганизмы являются источником для получения разнообразных целевых продуктов пищевого, кормового, медицинского и технического назначения. Знание закономерностей влияния физико-химических условий среды на рост и синтез клеточных макромолекул является научной основой для разработки новых биотехнологий. Процессы микробного синтеза делятся на два типа: 1) связанные с ростом клеток и образованием биомассы и происходящие со скоростью размножения клеток; 2) и происходящие или ускоряющиеся при замедлении скорости роста клеток (Перт, 1978; Работнова, 1975, 1984). Оптимизация обоих типов процессов осуществляется различными путями в зависимости от того, насколько совпадают скорости роста конкретного продуцента со скоростью синтеза макромолекул той или иной природы. Процесс микробного роста - это процесс синтеза первичных метаболитов (аминокислот, органических кислот, витаминов, нуклеотидов, промежуточных продуктов катаболизма) и их сборка в основные клеточные макромолекулы (белки, нуклеиновые кислоты). Оптимизация накопления биомассы клеток в культуре и синтеза первичных продуктов обмена сводится к оптимизации условий питания и созданию условий для сбалансированного роста продуцента. Накопление продуктов обмена запасной природы (полифосфатов, полисахаров, липидов) имеет место при несбалансированном росте вследствие исчерпания из среды какого-либо компонента питания для клеток и ограничения роста и синтеза основных (азотсодержащих) клеточных компонентов. Оптимизация процесса синтеза запасных соединений более сложна, так как требует специальных знаний о закономерностях образования этих макромолекул и специфических подходов в каждом конкретном случае. При ограничении роста микроорганизмов субстратными компонентами происходит замедление скорости роста клеток, сопровождающееся значительными изменениями химического состава, главным образом, соотношения основных и запасных макромолекул. Выявление принципиальных закономерностей этих изменений открывает широкие возможности для направленного синтеза клеточных макромолекул и получения целевых продуктов микробиологического процесса.
Изучение фундаментальной основы для разработки эффективных технологий получения целевых продуктов требует комплексных подходов. Ключевые задачи, решение которых необходимо для разработки и реализации эффективных технологий биосинтеза полигидрокисалканоатов, вытекают из следующих особенностей биотехнологии этих ценных макромолекул:

Первое, прокариотические микроорганизмы синтезируют полимеры гидроксипроизводных жирных кислот (ПГ А) в специфических условиях несбалансированного роста в качестве эндогенного депо энергии и углерода. Эти условия специфичны: для одних продуцентов таковыми является дефицит азота в среде, для других - дефицит фосфатов, кислорода или иных компонентов субстрата (Lee, 1996; Steinbüchel, Füchstenbusch, 1998; Kessler, Witholt, 2001; Park et al., 2011). Поэтому для эффективного получения ПГА необходим поиск и оценка новых продуцентов и выявление факторов, максимизирующих выходы полимеров.
Второе, ПГА - это семейство полимеров различного состава, физикохимические свойства которых (молекулярная масса, кристалличность, скорости разрушения в биологических средах) значительно варьируют в зависимости от химического строения (Сох 1994; Ashraf et al., 1999; Chia et al., 2010). Выявление микроорганизмов и условий, позволяющих получать полимеры различного химического состава - необходимая часть разработки способов синтеза новых полимеров с заданными свойствами.
Третье, масштабы производства и широкого применения ПГА во многом зависят от их стоимости, определяемой, прежде всего, видом и стоимостью используемых субстратов (Нерпег, 1996; Hazenberg, Witholt, 1997; Choi, Lee, 1999). Поэтому изыскание штаммов-продуцентов, способных синтезировать ПГА на доступном сырье, включая отходы производств, - важная задача биотехнологии этих ценных макромолекул.
Это определило направление исследований настоящей работы, ориентированной на выявление новых штаммов-продуцентов и комплексное исследование закономерностей и условий эффективного синтеза ПГ А.
Цель и задачи исследования - поиск новых продуцентов ПГА среди представителей фото- и хемолитоавтотрофных прокариотических микроорганизмов и выявление факторов, усиливающих продукцию полигидроксиалканоатов в качестве научной основы для эффективной технологии биосинтеза.

Для достижения цели сформулированы следующие задачи:

- выбор штаммов, обладающих способностью к синтезу и внутриклеточной аккумуляции ПГА среди сине-зеленых, светящихся, аэробных карбоксидобактерий и водородокисляющих прокариот;
- сравнительное исследование особенностей состава липидов и выходов ПГА у сине-зеленых, светящихся и водородокисляющих прокариот -потенциальных продуцентов ПГ А;
- изучение влияния условий культивирования на синтез внутриклеточных компонентов запасной и основной природы и выявление факторов, усиливающих продукцию ПГ А у отобранных штаммов-продуцентов;
- исследование закономерностей функционирования клеточного цикла ПГ А, протекторной роли и влияния ПГА на физиолого-биохимические характеристики штамма-продуцента;

у карбоксидобактерий несколько шире, чем у водородных бактерий. Рассчитанные по экспериментальным кривым значения по СО для А. еиРорИт и 5. carboxydohydrogena составили 2.5 и 4.7 мг/л, соответственно.
Под воздействием ингибиторов, как правило, направление метаболизма у микроорганизмов изменяется и эффективность расходования энергетического субстрата снижается (Перт, 1978). В культурах водородных бактерий и карбоксидобактерий с увеличением концентрации СО траты ростового субстрата возрастали (таблица 3.6). При предельных для бактерий концентрациях СО, когда ц была ниже 0.1 ч'1, экономические коэффициенты по водороду не превышали 20-30 % от исходных значений удельной скорости роста бактерий, выращиваемых без СО. Дополнительное расходование водорода связано с увеличением метаболических трат и возрастанием "холостого окисления".
Таблица 3.6. Показатели газообмена и химический состав А. еШгоркт Ъ и 5. carboxydohydrogena 21062 при изменении концентрации СО в культуре
Концентрация СО, % об Стехиометрия газопоглощения культурой С02:02:Н2 Химический состав клеток, % сухой биомассы Хнасыщ.
Белок Липиды ПЗГБ Иненасыщ.
А. еиігоркт Ъ
0 1 1.4: 4.7 57.2 10.3 Сл. 0.
10 1 3.4 : 11.0 60.2 10.1 0.6 0.
20 1 3.2 : 9.1 60.0 10.1 Сл. 0.
30 1 5.6 : 20.0 59.4 10.0 Сл. 0.
У. сагЪохуАокуАго^епа Ъ1
0 1 2.0 : 5.5 58.7 9.1 Сл. 0.
10 1 2.5 : 6.5 59.5 1 1.0 0.2 0.
20 1 4.0 : 10.0 58.0 10.6 Сл. 0.
30 1 4.2 : 12.0 59.2 11.0 2.2 0.
40 1 6.0 : 18.0 60.2 Н/д 1.2 0.
При анализе химического состава А. елАгорИих и 5. carboxydohydrogena (таблица 3.6), не выявлено влияния СО на синтез запасных веществ. Содержание общего азота и белка в бактериях во всём диапазоне исследованных концентраций СО и, следовательно, скоростей роста составляло 10.5-11.5 и 60-65 %, соответственно, то есть практически было максимальным. Ингибирующее воздействие СО, сопровождающееся существенным повышением трат энергетического субстрата культурой, по всей вероятности, и обеспечивало нормальное функционирование анаболических систем, включая фиксацию СОг и синтез мономеров в клетках. В итоге, в клетках сохранялась белковая "программа" синтеза макромолекул. При ингибировании роста водородных бактерий и карбоксидобактерий СО, несмотря на значительное снижение скорости роста бактерий при больших концентрациях СО (р составляла менее 0.1 ч'1), клетки не накапливали запасных продуктов в виде ПЗГБ.