Получение моноспецифических антител к сурвивину для структурно-функциональных исследований белка и онкодиагностики

• Автор: Аскарова, Елена Владимировна
• Шифр специальности: 03.01.06, 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 126 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ «СТРУКТУРНЫЕ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ СУРВИВИНА - ПРЕДСТАВИТЕЛЯ СЕМЕЙСТВА БЕЛКОВ-ИНГИБИТОРОВ АПОПТОЗА»
1.1. СУРВИВИН - ПРЕДСТАВИТЕЛЬ СЕМЕЙСТВА БЕЛКОВ-ИНГИБИТОРОВ АПОПТОЗА
12. Структурные особенности сурвивина
121 BIR-домен
12 2 С-концевая а-спиралъ
12 3 Участки димеризации
12 4 Сигнал ядерного экспорта
1.3 БЕЛКИ-ПАРТНЕРЫ СУРВИВИНА
13 1 Ran
13 2 Комплекс хромосомных пассажиров
13 3 Гистон ИЗ
13 4 Smac
13 5 IAP-IAP комплексы
13 6 Hsp90
13 7 Тубулин
13 8 HBXIP
139 STAT3
1 4. ФУНКЦИИ СУРВИВИНА В КЛЕТКЕ
14 1 Ингибирование апоптоза
14 2 Регуляция клеточного деления
14 3 Функции сурвивина в онкогенезе
1.5. Изоформы сурвивина
15 1 Строение основных изоформ сурвивина
15 2 Локализация изоформ сурвивина в клетке
15 3 Функции изоформ сурвивина
1.6. Взаимосвязь локализации сурвивина в клетке и выполняемых им функций
1.7. Димеризация сурвивина и ее влияние на локализацию белка в клетке
1 8 Взаимосвязь структуры и функций сурвивина
181 Гомодимер сурвивина
182 Гетеродимеры сурвивина
1 9. Посттрансляционные модификации сурвивина и их влияние на функции белка.
19 1 Фосфорилирование
19 2 Ацетилирование
19 3 Убиквитинирование
110 Сурвивин как прогностический биомаркер онкозаболеваний

II. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
2 1 Выбор фрагментов сурвивина для получения антител
2 2 Получение панели моноспецифических антител к различным участкам сурвивина
с помощью синтетических пептидов
2 21 .Получение иммунных сывороток к синтетическим фрагментам сурвивина и изучение их свойств
2 2 2 Выделение моноспецифических антител из сывороток с помощью аффинной хроматографии
2 3 Исследование свойств полученных моноспецифических антител к сурвивину
2 31 Определение способности антител связываться с рекомбинантным сурвивином
2 3 2 Изучение способности антител к пептидам (122-Е,2<,-134) и (122-К1М-134)
различать природную аминокислотную замену
23 3 Установление участков связывания антител
2 3 4 Изучение способности противопептидных антител выявлять эндогенный сурвивин в
лизатах опухолевых клеток
2 3 5 Ичмуноцитохимическое исследование клеток НеЬа, находящихся на различных стадиях клеточного цикла, с помощью противопептидных антител к сурвивину
2 4 Разработка подхода к выделению сурвивина из лизата опухолевых клеток НеЬа помощью противопептидных антител
2 5 Исследование диагностического потенциала противопептидных антител к
сурвивину
2 5 1 Исследование образцов опухолевых и смежных с опухолью тканей молочной железы с помощью моноспецифических антител к сурвивину
2 5 2 Исследование серии образцов опухолевых тканей мочевого пузыря с помощью противопептидных антител к сурвивину методом им муноблота
2 5 3 Иммуногистохимическое исследование серии образцов рака мочевого пузыря с
помощью противопептидных антител к сурвивину
III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
3 1 Химические реагенты и биологические препараты
3 2 Оборудование и расходные материалы
3 3 Животные
3 4 Культуры клеток
3 5 Образцы тканей
3 6 Состав буферов
3 7 Получение конъюгатов пептидных фрагментов с овалъбумином
3 8 Получение конъюгатов пептидных фрагментов с КЪН
3 9 Иммунизация животных и приготовление сывороток крови
3 10 Твердофазный иммуноферментный анализ
3 11 Приготовление аффинных сорбентов
3 111 Приготовление аффинного сорбента с иммобилизованным пептидом

3 112 Приготовление аффинного сорбента с иммобилизованными антителами
3 12 Аффинная хроматография противопептидных сывороток
3 12 1 Проведение аффинной хроматографии — стандартная методика
3 12 2 Проведение аффинной хроматографии - модифицированная методика
3.13. Приготовление лизатов клеток
3 13 1 Ведение клеточных культур
3 13 2 Замораживание и размораживание клеток
3 13 3 Приготовление лизатов клеток
3.14. Приготовление гомогенатов ткеней молочной железы и мочевого пузыря
3.15. Определение концентрации тотального белка в лизатах клеток и гомогенатах
тканей по методу Брэдфорд
3 15 1 Приготовление реагента Брэдфорд
3 15 2 Определение концентрации белка по Брэдфорд
3.16. Иммунопреципитация сурвивина с помощью сорбентов с иммобилизованными
антителами к сурвивину
3 16 1 Иммунопреципитация рекомбинантного сурвивина из раствора
3 16 2 Иммунопреципитация сурвивина из лизата клеток НеЬа
3 17. Иммуноблот
3.18 Иммуноцитохимическое исследование клеток линии НеЬа
3 19 ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ОБРАЗЦОВ ОПУХОЛЕВЫХ ТКАНЕЙ МОЧЕВОГО
ПУЗЫРЯ И МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1.5.3. Функции изоформ сурвивина
В белковой последовательности сурвивина-2В усечен ВЖ-домен, кроме того, в данной изоформе появляются новый потенциальный сайт М-гликозилирования и два потенциальных сайта Гч-миристоилирования. Эти различия с последовательностью полноразмерного белка приводят к значительным изменениям соответствующей белковой структуры и к изменению способности подавлять апоптоз. В отличие от полноразмерного сурвивина сурвивин-2В проявляет проапоптозные свойства. Повышенная экспрессия сурвивина-2В приводит к уменьшению популяции митотических клеток, а также сенсибилизирует раковые клетки к действию таксола и приводит к их смерти, тогда как подавление экспрессии данной изоформы приводит к тому, что раковые клетки становятся невосприимчивыми к лечению таксолом [91, 94]. Подавление экспрессии сурвивина-2В в раковых клетках ЯК О (линия клеток карциномы кишечника) и НТ-29 (линия клеток аденокарциномы кишечника) также повышает их устойчивость к воздействию индометацина [95].
Сурвивин-2В, локализуясь в ЦОМТ, взаимодействует с у-тубулином, играющим ключевую роль в полимеризации а/(3-тубулина, нарушая процессы образования тубулиновых волокон и филаментов вокруг ЦОМТ, в результате чего клетки остаются в фазе митоза С2. Сурвивин-2В митохондриальной локализации участвует в регуляции митохондриального (внутреннего) пути апоптоза. Высокий уровень экспрессии сурвивина-2В приводит к снижению уровня экспрессии антиапоптозного белка Ьс1-2 и повышению уровня экспрессии проапоптотического белка Вах. Митохондриальный белок Ьс1-2 играет важную роль в блокировке митохондриального пути программированной клеточной смерти, а значит, сниженная экспрессия Ьс1-2 облегчает индукцию апоптоза по данному пути. С другой стороны, известно, что переход Вах из цитоплазмы в митохондрии является ключевой стадией индукции внутреннего пути апоптоза. В здоровых клетках Вах находится в цитоплазме, где он неактивен, при апоптозе же он подвергается конформационным изменениям и перемещается в митохондрии. Таким образом, высокий уровень митохондриального Вах при повышенной экспрессии сурвивина-2В, вероятно, отражает переход Вах из цитоплазмы в митохондрии. Экспрессия сурвивина-2В также приводит к выходу Бтас из митохондрий, изменению митохондриального потенциала, активации каспаз-9 и -3, в то время как каспаза-8 остается в неактивном состоянии [91].
Сурвивин-АЕхЗ способен препятствовать активации каспазы-3. Так, при воздействии на клетки эпителиомы печени человека (линия клеток НерЗВТ2) белка