Связывание уабаина и маринобуфагенина с Na,K-ATРазой

• Автор: Климанова, Елизавета Андреевна
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2015
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 110 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Структура Na,K-ATPa3bi. Изоформы а- и Р-субъединиц
2. Механизм гидролиза АТР и транспорта ионов Na.K-АТРазой
3. Катионсвязываюшие центры Na.K-АТРазы
4. Регуляция активности 14а,К-АТРазы
5. Олигомеризация Na,K-ATPa3bi
6. Конформационные изменения Na.K-АТРазы
7. Na.K-АТРаза - рецептор кардиотонических стероидов
8. Связывание Na.K-АТРазы с кардиотоническими стероидами
9. Биосинтез кардиотонических стероидов
10. Токсический эффект кардиотонических стероидов
11. Физиологические эффекты кардиотонических стероидов
ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Материалы
2. Методы
2.1. Получение фракции микросом из солевых желез утки
2.2. Очистка Na,К-АТРазы из микросом солевых желез уток
2.3. Определение концентрации белка
2.4. Определение активности 14а,К-АТРазы
2.4.1. Определение активности Na.K-АТРазы по накоплению Pi
2.4.2. Определение активности с использованиел1 системы сопряженных ферментов
2.5. Исследование ингибирования Na.K-АТРазы под действием КТС и расчет 1С50
2.6. Одномерный электрофорез в полиакриламидном геле
2.7. Вестерн-блоттинг
2.8. Методы регистрации конформационных изменений, индуцированных связыванием Na.K-АТРазы с кардиотоническими стероидами
2.8.1. Включение флуоресцеинизотиоцианата (ФИТЦ) в препараты Na,K-АТРазы из солевых желез утки
2.8.2. Включение 5-иодацетамидфлуоресцеина (5-ИАФ) в препараты Na,K-АТРазы, полученные из солевых желез утки
2.8.3. Измерение флуоресценции ФИТЦ- и 5-ИАФ-меченных препаратов
Na,К-АТР азы, полученных из солевых желез утки
2.8.4. Регистрация конформационных переходов при связывании различных лигандов методом изотермической калориметрии титрования
Устройство прибора VP-1TC Micro Calorimeter
Изотермическая калориметрия титрования
2.9. Молекулярное моделирование
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
1. Характеристика препаратов №,К-АТРазы, полученных из солевых желез утки
2. Ингибирование Ыа,К-АТРазы уабаином и маринобуфагенином
3. Изучение взаимодействия Ыа,К-АТРазы с уабаином и маринобуфагенином с помощью измерения флуоресценции ковалентно связанных с ферментом меток
4. Изучение взаимодействия Na.K-АТРазы с уабаином и маринобуфагенином методом изотермической калориметрии титрования
5. Моделирование участка а-субъединицы Na,К-АТР азы, связанного с молекулой маринобуфагенина
6. Изучение взаимодействия №,К-АТРазы с AMP, ADP и АТР методом изотермической калориметрии титрования
7. Изучение взаимодействия Na,K-ATPa3bi с уабаином и маринобуфагенином в присутствии ADP и АТР методом изотермической калориметрии титрования
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ
5-ИАФ - 5-иодацетамидфлуоресцеин ADP - адепозинднфосфат
AEBSF -4-(2-аминоэтил)бензенсульфонилфторид гидрохлорид
АМР - аденозинмонофосфат
АТР — аденозинтрифосфат
ВАХ - белок, вызывающий аноптоз
Вс1-2 — белок, подавляющий апоптоз
C7-MDCK ~ линия клеток почечного эпителия собаки
СНО — линия клеток яичников китайских хомячков
DMSO - диметилсульфоксид
Е-64 - (1S, 28)-2-(((8)-1-((4-гуанидинобутил)амино)-4-метил-1-оксопентан-2-ил)карбамоил)циклопропанкарбоксильная кислота
EGF(R) - эпидермальный фактор роста
ERK1/2 — протеинкиназы, активируемые внеклеточными сигналами
ITC - изотермическая калориметрия титрования
JNK - стресс-активируемые протеинкиназы
Mal04 - линия клеток почечного эпителия обезьяны
МАРК - митоген-активируемая протеинкиназа
NAD+ - никотинамидадениндинуклеотид окисленный
NADH - никотинамидадениндинуклеотид восстановленный
PBST - фосфатно-солевой буфер, содержащий 0,1% твин
Pi - фосфат неорганический
Р13К — фосфатидилинозитол-3-киназы
РКА — протеинкиназа А
РКС - протеинкиназа С

Было показано, что фосфорилирование Иа-насоса неорганическим фосфатом в присутствии ионов М£2~ обеспечивает наиболее высокое сродство к фермента к уабаину. Уайте й а1. измеряли константы диссоциации для комплекса уабаии-фермент, преинкубируя Ха.К-ЛТРазу с Рц ионами Mg2+ и уабаином [117]. В отсутствие ионов К+ константа диссоциации составила 3 нМ, добавление ионов К+ значительно снижало сродство к уабаину: значение Ка увеличилось со 130 до 420 нМ в присутствии 10 и 50 мМ КС1 соответственно [118].
9. Биосинтез кардиотонических стероидов
Несмотря на то, что строение и механизм действия КТС в настоящий момент довольно подробно изучены, до конца остается неясным, как осуществляется биосинтез этих соединений. Как уже говорилось ранее, различные КТС обнаружены во многих тканях млекопитающих (плазма крови, гипоталамус, сердце, надпочечники). Целый ряд данных свидетельствует о том, что биосинтез кардиостероидов происходит в коре надпочечников [119], [120], [121], [122]. Согласно классической схеме синтеза стероидов, для образования молекулы эндогенного уабаина, который относится к семейству карденелидов, требуется отщепление боковой цепи холестерина (превращение холестерина в прегненолон) [120]. Ингибирование следующего этапа стероидогенеза (превращения прегнеполона в прогестерон) снижает синтез эндогенного уабаина клетками коры надпочечников [119]. Таким образом, прегненолон и прогестерон являются предшественниками эндогенного уабаина.
Синтез буфадиенолидов также осуществляется в клетках коры надпочечников. Однако прогестерон не является предшественником маринобуфагснина. При этом мевастатин, являющийся ингибитором З-гидрокси-З-метилглутарил-СоА-редуктазы, снижает уровень синтеза маринобуфагенина, что свидетельствует о том, что для биосинтеза буфадиенолидов необходим холестерин [123].
10. Токсический эффект кардиотонических стероидов
В настоящее время точные причины, объясняющие цитотоксический эффект кардиотонических стероидов, неизвестны. Существуют лишь некоторые предположения о возможных механизмах, лежащих в основе данного явления.