Моноклональные антитела против ангиотензин-превращающего фермента для направленной доставки изотопов и генетического материала в эндотелий легких

• Автор: Гаврилюк, Виталий Дмитриевич
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Место защиты: Б. м.
• Количество страниц: 115 с. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ
Оглавление

Список сокращений

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Направленный транспорт веществ

1.1.1. Введение

1.1.2. Легочный эндотелий как мишень для направленной доставки лекарственных

веществ

1.1.3 Эндотелиальные антигены для направленной доставки лекарств к легким

1.1.3.1. Ангиотензин превращающий фермент (АПФ)
1.1.3.2. Тромбомодулин (ТМ)
1.1.3.3. Поверхностные молекулы адгезии ICAM-1, РЕСАМ-
1.1.3.4. Другие антигены
1.1.4. Антитело-зависимый направленный транспорт веществ к эндотелию легких..
1.1.4.1. Иммуносцинтиграфия
1.1.4.2. Доставка фибринолитиков и антикоагулянтов
1.1.4.3. Доставка антиоксидазных агентов
1.1.4.4. Доставка липосом
1.1.5. Доставка генетического материала к эндотелию легких
1.1.5.1. Генная терапия легких
1.1.5.2. Вектора для доставки генетического материала
1.1.5.3. Невирусные методы доставки генов
ПДА Вирусные вектора
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Модификация моноклональных антител против АПФ
2.1.1 Мечение моноклональных антител радиоактивными изотопами
2.1.1.1 Мечение антител радиоактивным изотопом иода
2.1.1.1а. Мечение иодогеном
2.1.1.16. Мечение реактивом Болтон-Хантера (Bolton-Hunter)

2.1.1.1с. Мечение хлорамином Т на бусах (iodo-beads)
2.1.1.2 Мечение антител радиоактивным изотопом индия (1п1п)
2.1.1.3 Мечение антител радиоактивным технецием (99Тс)
2.1.2 Биотинилирование антител
2.1.2.1. Биотинилирование антител
2.1.2.2. Изоэлектрофокусирование антител
2.1.3 Получение биспецифических антител
2.1.3.1 Конъюгирование антител или Fab фрагментов через SPDP
2.1.3.2. Получение bis-конъюгированных антител
2.2. Биораспределение и накопление в легких экспериментальных животных моноклональных антител, их конъюгатов и модификаций
2.2.1. Биораспределение меченных моноклональных антител в организме экспериментальных животных
2.2.2. Изолированные перфузированные легкие
2.2.3. Изучение распределение эндотелиальных антигенов в сосудистом русле крысы
2.3. Создание клеточной модели АПФ-зависимого направленного транспорта
2.3.1. Получение вектора с полной последовательностью, кодирующей АПФ
2.3.2. Культивирование и трансфекция СНО клеток
2.3.3. Определение активности ангиотензин-превращающего фермента
2.3.4. Иммуноферментный анализ содержания АПФ на клетках (CELL ELISA)
2.3.5. Электрофорез и Вестерн-блоттинг
2.3.6. Иммуноцитохимический анализ клеточной культуры
2.4. Конъюгирование антител против АПФ с генетическим материалом
2.4.1 Конъюгирование олигонуклеотидов с моноклональными антителами
2.4.2. Конъюгирование модельной днк с антителами
2.5. Анализ взаимодействия моноклональных антител и их конъюгатов с АПФ
2.5.1. Радиоиммуносорбция меченых антител на АПФ иммобилизованным на пластике
2.5.2. Иммуносорбция активности АПФ из раствора
2.5.3. Иммуноферментный анализ АПФ

2.6. Конъюгирование моноклональных антител 9В9 с аденовирусом
2.6.1. Получение аденовируса
2.6.2. Взаимодействие вирусных частиц, покрытых конъюгатом 9В9-анти-кноб-РаЬ с клетками
2.6.3. Определение активности люциферазы
2.6.3.1. Определение активности люциферазы в лизатах клеточных культур
2.6.3.2.0пределение активности люциферазы в гомогенатах органов
2.6.4. Определение (З-галактозидазной активности
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 Модификация антител против АПФ для визуализации сосудов легких и направленного транспорта лекарств к легочному эндотелию
3.1.1. Сравнение различных методов-мечения антител радиоизотопами для визуализации сосудов легких
3.1.2. Биотинилирование моноклональных антител к АПФ
3.1.2.1 Подбор условий биотинилирования
3.1.2.2. Проверка иммунологических свойств биотинилированых моноклональных антител 9В
3.1.2.3 Проверка антигеневязывакнцей активности биотинилированых антител 9В
in vitro
3.1.2.4. Проверка антигеневязывакнцей активности биотинилированых антител 9В9 in vivo
3.1.3 Получение биспецифических антител - коньюгатов моноклональных антител к АПФ с другими антителами
3.1.3.1. Получение коньюгата 9В9 и антител, направленных против FLAG эпитопа аденовируса
3.1.3.2. Получение бис-коньюгатов антител
3.1.3.3 Получение коньюгата моноклональных антител к АПФ с Fab фрагментом антител против поверхностного knob-белка аденовируса
3.2 Сравнение разных антител к эндотелиальным антигенам в качестве вектора для направленной доставки лекарств к эндотелию сосудов легких
3.2.1. Распределение эндотелиальных антигенов в сосудистом русле крысы

составленного из: 500 мкл водного раствора пирофосфата натрия (10 мг/мл), 5 мкл раствора SnCl2 в 1 М НС1 (20 мг/мл) и 5 мкл 5 М NaOH. Раствор готовили непосредственно перед употреблением.
К полученной смеси добавляли 0,5-2 mCi пертехнетата натрия и инкубировали 5 минут при комнатной температуре. Несвязавшийся 99Тс отделяли на колонке PD-10. Удельная радиоактивность полученных препаратов была в пределах 2-2.5 pCi/мг белка.
2.1.2 Биотинилирование антител.
2.1.2.1. Биотинилирование антител.
Биотинилирование моноклональных антител проводилось согласно описанию Muzykantov et al,, 1986. Раствор антител (2 мг/мл) в 50 мМ боратном буфере инкубировали с соответствующим количеством N-сукцинил-малеимидным эфиром биотина в диметилсульфоксиде (DMFA, Sigma, USA) при +4°С в течение 1 часа. От несвязавшегося биотина отделялись с помощью гель-фильтрации на колонке PD-10 с гелем Сефадекс G-25, уравновешенным физиологическим раствором.
2.1.2.2. ИЗОЭЛЕКТРОФОКУСИРОВАНИЕ АНТИТЕЛ.
Изоэлектрофокусирование биотинилированых антител проводили в капиллярах, заполненных 7.5% денатурирующим полиакриламидным гелем с соответствующими амфолинами (pH 3.5-10; 4-6; 5-7). Гель готовили следующим образом: 5.8 г мочевины растворяли в 2 мл дистиллированной воды, добавляли 200мкл соответствующего амфолина, 2 мл 10% NP-40 и 1 мл ИЭФ-акриламида (1.5 г акриламида и 40 мг бис-акриламида в 5 мл воды). Объем раствора доводили до 10 мл дистиллированной водой. Для полимеризации геля к раствору добавляли 7 мкл TEMED (Bio-Rad, USA) и 10 мкл 20% персульфата аммония. Раствор перемешивали и заливали в 0.05x10 см стеклянные капилляры.
Как катодный буфер использовали 0.1 М NaOH, как анодный - 0.1 М Н3РО4.
К 100 мкл антител (5-100 мкг белка) добавляли 60 мг мочевины и 2 мкл NP-40. Пробу перемешивали до полного растворения мочевины. 10-20 мкл пробы вносили в верхнюю часть капилляра и проводили фокусирование в следующем режиме: 100В -