Разработка и применение исследовательско- диагностического комплекса для изучения клеток крови на основе иммунологических биочипов

• Автор: Шишкин, Александр Валентинович
• Шифр специальности: 14.01.21
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 245 с. : 49 ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список используемых сокращений
ВВЕДЕНИЕ
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ '
1.1 Комплексный принцип диагностики гемобластозов
1.2 Иммунодиагностика гемобластозов
1.3 Методы иммунофенотипирования клеток
1.3.1 Реакция агглютинации
1.3.2 Реакция иммунного лизиса
1.3.3 Розеткообразование
1.3.4 Пэннинг
1.3.5 Фракционирование клеток с помощью иммуномагнитных 28 микробус
1.3.6 Радиоиммунные методы исследования клеток
1.3.7 Иммуноферментные (иммуноцитохимические) методы
1.3.8 Иммунофлуоресцентные методы
1.3.9 Методы электронномикроскпической иммуноцитохимии
1.3.10 Проточная цитофлуориметрия
1.3.11 Анализ с использованием иммунологических биочипов 34 (иммунобиочипов)
1.4 Методы комбинированных исследований клеток
1.5 Конструкции биочипов

1.6 Изготовление биочипов 3
1.7 Опыт разработки и применения биочипов для определения 42 поверхностных молекул на различных типах клеток
1.8 Пробоподготовка и проведение анализа
1.9 Заболевания, при которых выполнялись исследования
1.9.1 Хронический лимфоцитарный лейкоз
1.9.2 Фолликулярная лимфома
1.9.3 Лимфома из клеток мантийной зоны
1.9.4 Волосатоклеточный лейкоз
1.9.5 Лимфома из клеток маргинальной зоны селезенки
1.9.6 Острые лимфобластные лейкозы
1.9.7 Острые миелоидные лейкозы 71 Глава 2. МАТЕРИАЛЫ, МЕТОДЫ И ОБЪЕКТ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1 Характеристика обследованных больных
2.2 Объем проведенных исследований
2.3 Материалы
2.3.1 Расходные материалы
2.3.2 Антитела
2.3.3 Реактивы
2.3.4 Растворы
2.3.5 Оборудование
2.3.6 Программное обеспечение
2.4 Методы клинического бследования больных

2.5 Общие принципы проведения анализа с использованием
разработанного исследовательско-диагностического комплекса
2.6 Устройство биочипа первоначальной конструкции
2.7 Изготовление биочипов
2.7.1 Изготовление биочипов методом микроконтактного
нанесения
2.7.2 Изготовление биочипов с помощью автоматической
микропипетки
2.7.3 Изготовление биочипов с помощью самостоятельно
разработанного устройства
2.7.4 Контроль качества изготовления биочипов
2.7.5 Хранение биочипов
2.8 Пробоподготовка
2.8.1 Выделение мононуклеаров в градиенте плотности
2.8.2 Выделение лейкоцитов из периферической крови с 95 использованием лизирующего раствора
2.8.3 Приготовление суспензии лейкоцитов
2.8.4 Приготовление суспензии эритроцитов
2.9 Проведение анализа без использования проточной камеры
2.10 Проведение анализа с применением проточной камеры
2.11 Окрашивание клеток для проведения их морфологического 100 исследования
2.12 Цитохимические исследования связавшихся с биочипом 101 клеток

антителами. Поэтому, в отличие от пэннинга, данный метод позволяет определять большое число антигенов на разных клетках. Преимуществом анализа с применением биочипов также является крайне низкий расход растворов антител (до 10 нл для нанесения одного тестового участка [214]).
Недостатком метода можно считать определение на каждой отдельно взятой клетке только одного антигена по факту ее связывания в том или ином тестовом участке с иммобилизованными антителами. Но данная проблема может быть решена путем обработки биочипа со связанными клетками флуоресцентно-меченными антителами [184, 188, 214, 219,244, 257, 276].
Из-за своей новизны данный метод еще не успел получить широкого распространения.
По сравнению с иммунофлуоресцентным и иммуноферментным методами он требует значительно меньшего расхода антител (при проведении анализа без определения коэкспрессии антигенов). Но при определении коэкспрессии антигенов на связавшихся клетках путем обработки биочипа меченными антителами их расход будет приблизительно одинаков. Тем не менее, за счет связывания каждой клетки в области того или иного тестового участка биочипа на ней будет определяться на один антиген больше.
Для решения этой же задачи анализ на биочипах, в принципе, может быть дополнен иммунорадиоизотопным исследованием связавшихся клеток. Однако, проведение подобных исследований заведомо будет ограничивать потенциальная опасность радиоактивно-меченных реактивов и необходимость применения дорогостоящих мер защиты.
По сравнению с методом проточной цитофлуориметрии использование биочипов имеет следующие преимущества: возможность одновременного определения большого числа поверхностных антигенов на разных клетках; возможность определения поверхностных антигенов клеток параллельно с проведением их дополнительных исследований (например, морфологического