Влияние парушений функции опухолевого супрессора р53 на васкуляризацию опухолей: идентификация неизвестных ранее сигнальных путей и механизмов

• Автор: Хромова, Наталья Викторовна
• Шифр специальности: 14.01.12
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 87 с. : 32 ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список сокращений

Введение б

1. Обзор литературы

1.1. Васкуляризация опухолевых тканей и ее роль в прогрессии 9 новообразований

1.1.1 .Образование кровеносных сосудов - необходимое условие 10 прогрессивного роста опухоли

1.1.1.1. Механизмы кровоснабжения опухолей

1.1.1.2. Опухолевый гемангиогенез и регулирующие его факторы

1.1.1.3. Васкулогенная мимикрия

1.1.2. Опухолевый лимфангиогенез: механизмы и значение для 29 прогрессии опухолей

1.2. Роль опухолевого супрессора р53 в контроле васкуляризации опухолей

1.2.1 Общие сведения о строении и активностях р53
1.2.2. Изменения р53 в опухолевых клетках и их последствия
1.2.2.1. Роль р53 в контроле гемангиогенеза
2. Материалы и методы
2.1. Бактериальные штаммы и плазмиды
2.2. Методы молекулярного клонирования
2.3. Эукариотические клеточные линии
2.4. Инфекция опухолевых клеток
2.5. Анализ экспрессии генов
2.6. Вестерп-блот гибридизация
2.7. Эксперименты на культурах опухолевых клеток
2.8. Эксперименты на бестимусных мышах
2.9. Иммуногистохимический анализ препаратов тканей опухолей
2.10. Статистическая обработка результатов
3. Результаты исследования
3.1. Роль нарушений р53 в опухолевом гемангиогенезе
3.1.1. Влияние нарушений р53 на размножение клеток НСТ116 in vitro и
in vivo
3.1.2. Влияние нарушений р53 на рост опухолевых кровеносных сосудов
3.1.3. Влияние нарушений р53 на уровень АФК и синтез HIF-la
3.1.4. Влияние антиоксиданта NAC на уровень АФК, синтез HIF-la и
гемангиогенез
3.1.5. Влияние повышения уровня АФК, вызванного подавлением
экспрессии фактора теплового шока НБР1, на гемангиогенез и опухолевый рост
3.2. Роль нарушений р53 в васкулогенной мимикрии
3.2.1. Влияние нарушений р53 на экспрессию молекулярных маркеров 71 васкулогенной мимикрии и содержание в опухолях ламининовых структур
3.3. Роль нарушений р53 в опухолевом лимфангиогенезе
3.3.1. Влияние нарушений р53 на рост лимфатических сосудов
3.3.2. Влияние нарушений р53 на экспрессию генов VEGFC, VEGFD
3.4. Роль VEGF-C в васкуляризации опухолей
3.4.1. Получение сублиний НСТ116 и А549 с подавленной продукцией 77 VEGF-C
3.4.2. Влияние подавления продукции VEGF-C на пролиферацию и 80 миграцию опухолевых клеток in vitro
3.4.3. Влияние подавления продукции VEGF-C на скорость роста 83 и кровоснабжение опухолей
3.4.3.1. Влияние подавления VEGF-C на гемангиогенез
3.4.3.2. Влияние подавления VEGF-C на васкулогенную 85 мимикрию
3.4.4. Влияние подавления продукции VEGF-C на опухолевый 86 лимфангиогенез
4. Обсуждение полученных результатов
4.1. Роль нарушений р53 в васкуляризации опухолей
4.2. Роль нарушений VEGF-C в васкуляризации опухолей
Выводы
Список литературы

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АФК - активные формы кислорода
ОТ - реакция обратной транскрипции
п.н. - пара нуклеотидов
РМЖ - рак молочной железы
РШМ - рак шейки матки
ЭТС - эмбриональная телячья сыворотка
В All- (Brain-specific Angiogenesis Inhibitor 1) - специфический для мозга ингибитор ангиогенеза
СВР - (CREB-Binding Protein) - CREB-связывающий белок
CCL21 - (С-С motif) Ligand 21) - хемокин (С-С мотив) лиганд
CCR7 - (С-С chemokine receptor type 7) рецептор 7 типа С-С хемокина
COL4A1 - (Collagen alpha-1 (IV) chain) - Коллаген альфа-1 (IV) цепи
СОХ-2 - (Cyclooxygenasc-2) - цшслооксигеназа
DAPI — (4',6-Diamidino-2-phenylindole) - 4',6-диамидино-2-фенилиндол
DCF-DA - (2',7'-dichlorofluorescein diacetate) - Т-Т дихлородигидрофлуоресцин диацетата
DMSO - (Dimethyl sulfoxide) - диметил сульфоксид
EGF - (Epidermal Growth Factor) - эпидермальный ростовой фактор
FGF - (Fibroblast Growth Factor) - фактор роста фибробластов
FN1 - (Fibronectin) - фибронектин 1-го типа
ERB1 - (Eukaryotic Ribosome Biogenesis Protein 1) - белок 1 биогенеза рибосом эукариот ERK - (Extracellular signal-Regulated Kinases) - внеклеточного-регулируемые киназы Flk-1/KDR - (Fetal Liver Kinase 1- мышиный гомолог/Kinase insert Domain containing Receptor-человеческий гомолог VEGFR-2)
GFP (Green Fluorescent Protein) - зеленый флюоресцентный белок
HGF/SF - (Hepatocyte Growth Factor/Scatter Factor) - фактор роста гепатоцитов/фактор рассеивания
HIF-1 (Hypoxia Inducible Factor) - фактор, индуцируемый гипоксией HRP - (Horseradish Peroxidase) - пероксидаза хрена HSF1 - (Heat Shock Factor) фактор теплового шока
hTERT - (Human Telomerase Reverse Transcriptase) - теломераза обратной транскриптазы человека
ID4 - (Inhibitor of DNA binding 4) - ингибитор связывания ДНК
IL - (Interleukin) - интерлейкин
INFa - (Interferon- a) - интерферон a
LAMC2 - (Laminin Gamma-2 Chain) - ламинин 5 y2 цепь
LYVE-1 - (LYmphatic Vessel Endothelial hyaluronan receptor) - рецептор 1 гиалуронана эндотелия лимфатических сосудов
МАРК - (Mitogen-Activated Protein Kinase) - киназа, активируемая митогенами
MDM2 - (Mouse Double Minute chromosome amplified oncogene) - онкоген, который был
амплифицирован на хромосоме типа «double minute».
MDR1 - (Multidrug Resistance Protein 1) - белок множественной лекарственной устойчивости
MIG-7 - (Migratory protein-7) - мигрирующий белок
MMP - (Matrix metalloproteinase ) - матриксная металлопротеиназа
mTOR - (mammalian Target Of Rapamycin) — мишень рапамицина млекопитающих
NAC - (N-Acetyl-Çysteine) - N-ацетил-Е-аспартат
NFicB - (Nuclear Factor- кВ)- ядерный фактор энхансера к легкой полипептидной цепи в В-клетках
NKC - (Natural Killer Cells) - естественные киллерные клетки
PAS - (Periodic Acid Schiff-Stain) - периодическое окрашивание реактивом Шиффа
PI3K - (Phosphoinositide 3-Kinase) - фосфоинозитид-3 киназа

проницаемости лимфатических сосудов и пополнении пула клеток воспаления, которые продуцируют VEGF-C и VEGF-D [Cursiefen et al., 2004].
NRP-2 в регуляции лимфангиогенеза Недавно стало известно, что VEGF-C и VEGF-D также могут связываться с рецептором семейства нейропилинов - NRP-2, который экспрессируется на эндотелиальных клетках внутриопухолевых и периферических лимфатических сосудов и специфически ассоциируется с VEGFR-3. Именно поэтому, связывание лигандов с NRP2 усиливает биологические эффекты, индуцируемые взаимодействиями VEGF-C/VEGFR3 и VEGF-D/VEGFR3 [Favier et ah, 2006; Karpanen et al., 2006]. Более того, известно, что у НЕР2-дефицитных мышей наблюдается лимфатическая гипоплазия [Yuan, 2002]. На мышиных клетках рака молочной железы и клетках глиомы крысы было показано что, NRP2 регулирует опухолевый лимфангиогенез и мстастазирование в региональные лимфатические узлы и отдаленные органы [Caunt et al., 2008].
Хемокины и цитокины и их роль в опухолевом лимфаигиогенезе Сейчас хорошо известно, что VEGF-C и VEGF-D необходимы для лимфангиогенеза, и повышение их продукции коррелирует с метастазированием в лимфатические узлы и отдаленные органы. Однако, для лимфогенного мстастазирования недостаточно увеличения синтеза только VEGF-C и VEGF-D, так как для распространения опухолевых клеток по лимфатическим сосудам требуются и другие цитокины и хемокины. Так, например, ростовой фактор гепатоцитов (HGF), секретируемый опухолевыми клетками, обладает способностью стимулировать рост периферических лимфатических сосудов, активируя VEGFR-3 [Cao et al., 2006]. PDGF-ВВ (ростовой фактор тромбоцитов), индуцирующий антиапоптотические сигналы, стимулирует внутриопухолевый лимфангиогенез в мышиных фибросаркомах и их метастазирование в лимфатические узлы [Cao et al., 2004]. Сами клетки лимфатического эндотелия могут принимать участие в формировании метастазов, секретируя хемокины, такие как CCL21, чей рецептор CCR7 экспрессируется на опухолевых клетках, например, при раке молочной железы. К лимфатическим сосудам привлекаются CCR7-no3HTHBHbie опухолевые клетки, взаимодействующие с CCL21-позитивным эндотелием, и, таким образом, увеличивается лимфогенное распространение опухолевых клеток и метастазирование [Muller et al., 2001; Zlotnic, 2004]. Интерлейкин 7 (IL-7), взаимодействуя со своим рецептором, увеличивает экспрессию VEGF-D и, как следствие, индуцирует лимфангиогенез и метастазирование в лимфатические узлы при раке легкого [Ming et al., 2009].