Разработка и испытание живой сухой вакцины против эпизоотической диареи свиней (вакцина ВЕРРЕС-ЭДС) в экспериментальных и производственных условиях

• Автор: Сергеев, Олег Витальевич
• Шифр специальности: 06.02.02
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 185 с. : ил.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ: ЭПИЗООТИЧЕСКАЯ ДИАРЕЯ СВИНЕЙ
1.1. Общая характеристика и распространённость
1.2. Этиология
1.2.1. Вирусные гастроэнтериты свиней
1.2.2. Систематика вируса ЭДС
1.2.3. Структура вириона
1.2.4. Физико-химические свойства
1.2.5. Структурные белки
1.2.6. Неструктурный белок ОИТЗ
1.2.7. Структура генома
1.2.8. Антигенное родство
1.3. Культивирование
1.4. Эпизоотологические данные
1.5. Патогенез
1.6. Клинические признаки
1.7. Диагностика
1.8. Предупреждение и контроль
1.8.1. Общие меры
1.8.2. Специфическая иммунопрофилактика
1.9. Заключение по обзору литературы
1.10. Цель и задачи исследования
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Материалы и методы
2.2. Результаты исследований
2.2.1. Культуральные свойства и аттенуация полевого изолята
вируса ЭДС с целью получения вакцинного штамма
2.2.1.1. Серийное пассирование вируса в культуре клеток Уего
и оценка его аттенуации

2.2.1.2. Антигенность штамма ИС в зависимости
от длительности аттенуации вируса
2.2.1.3. Изменения в геноме штамма ИС вируса ЭДС как результат адаптации к культуре клеток Уего
2.2.2. Оптимизация условий массового культивирования вируса
2.2.2.1. Состояние культуры клеток
2.2.2.2. Зависимость накопления вируса от дозы заражения
2.2.2.3. Культивирование вируса ЭДС в роллерных
и статических условиях
2.2.2.4. Размножение штамма ИС в других линях клеток
и в сублиниях клеток Уего
2.2.3. Разработка технологии изготовления и контроля живой
сухой вакцины в экспериментальных условиях
2.2.3.1. Изготовление сухой вакцины
2.2.3.2. Контроль вакцины на безопасность и реактогенность
2.2.4. Разработка способа применения живой вакцины против ЭДС
2.2.4.1. Способ введения вакцины
2.2.4.2. Антигенность штамма ИС в зависимости
от прививочной дозы
2.2.4.3. Антигенность штамма ИС в зависимости
от кратности введения и дозы вакцины
2.2.4.4. Применение экспериментальной серии сухой вакцины
в неблагополучном по ЭДС хозяйстве
2.2.5. Изготовление и применение живой сухой вакцины ИС-ЭДС
в хозяйствах, неблагополучных по ЭДС
2.2.5.1. Изготовление и контроль живой сухой вакцины
в производственных условиях
2.2.5.2. Распространение ЭДС в крупных свиноводческих
хозяйствах России
2.2.5.3. Вакцинопрофилактика ЭДС в производственных условиях
2.2.5.4. Сравнительная эффективность двух вариантов
живой вакцины против ЭДС

2.2.6. Одновременная и последовательная вакцинация свиней
против ЭДС иТГС
2.2.6.1. Антигенность моновалентных живых вакцин
2.2.6.2. Антигенность бивалентной живой вакцины (ЭДС+ТГС).
2.2.6.3. Одновременное введение вакцин ИС-ЭДС и ТР-
2.2.6.4. Последовательная вакцинация супоросных свиноматок
против ТГС и ЭДС
3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ
4. ВЫВОДЫ И ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
5. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
6. ПРИЛОЖЕНИЯ
2.1.3. Выращивание вируса в культуре клеток
Для выращивания вируса использовали клетки Усго, покрывающие ростовую поверхность флакона на 95-100%. Клетки отмывали раствором Хэнкса и заражали вирусом с множественностью 0,1 ТЦД50 на клетку. Вирус вносили одновременно с поддерживающей средой (ОМЕМ с антибиотиками без сыворотки), содержащей трипсин в концентрации 5 мкг / мл. Выраженный ЦПЭ развивался через 18-20 часов после заражения. В этот период (разрушение не менее 70% клеток монослоя) культивирование вируса прекращали, и сосуды с инфицированной культурой клеток интенсивно встряхивали. В случаях, когда на стенках культуральных сосудов оставалась значительная часть клеток, сосуды кратковременно замораживали. Вируссодержащую культуральную суспензию сливали в пластиковые бутыли и хранили при -20°- -70°С. Вирус ЭДС, адаптированный к культуре клеток Уего (титр 103,5 - 106,0 ТЦДзо/мл), использовали для изготовления
экспериментальных серий вакцины.
2.1.4. Титрование вируса в культуре клеток
Инфекционность вируса в жидких и лиофилизованных препаратах определяли методом титрования в культуре клеток Уего в 96-луночных плашках.
Клетки Уего в 96-луночных плашках выращивали стандартным способом в атмосфере 4% С02. Концентрация клеток при посеве: 2-4 х 105 клеток / мл, в лунку вносили 100 мкл клеточной суспензии, срок формирования монослоя: 24-48 ч. Перед внесением разведений вируса монослой в лунках промывают 1-2 раза раствором Хэнкса. Серийные 10-кратные разведения вируса готовили в среде БМЕМ, содержащей трипсин (5 мкг / мл) и гентамицин (20 мкг / мл). Разведения от 10'1 до 10‘5 вносили в отмытые от ростовой среды лунки по 100 мкл, каждое разведение в 4 лунки. Плашки инкубировали при 37°С, 4% С02. Результаты титрования вируса