Разработка тест-системы для выявления антител к бактериям Moraxella bovis методом иммуноферментного анализа : ИКК-Серотест

• Автор: Саттарова, Наталья Валерьевна
• Шифр специальности: 06.02.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Казань
• Количество страниц: 136 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
СОДЕРЖАНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Инфекционный кератоконъюнктивит крупного рогатого скота
1.2 Характеристика и биологические свойства основного возбудителя инфекционного кератоконъюнктивита (ИКК) крупного рогатого скота -бактерий Moraxella bovis
1.3 Методы диагностики инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота
1.4 Методы иммуноанализа
1.5 Иммуноферментный анализ
2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1 Материалы и методы исследований
3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1 Эпизоотологический мониторинг ИКК крупного рогатого скота
3.2 Изучение биологических свойств культур бактерий, выделенных от животных, больных инфекционным кератоконъюнктивитом, на территории Республики Татарстан
3.3 Разработка тест-системы ИФА для серологической диагностики ИКК крупного рогатого скота и определения уровня поствакцинальных антител
3.3.1 Сравнительная оценка методов получения антигена бактерий Moraxella bovis
3.3.2 Подбор оптимальной схемы иммунизации животных для получения гипериммунной і сыворотки к бактериям Moraxella bovis

3.4 Разработка иммуноферментной тест-системы для выявления антител к бактериям Moraxella bovis при тестировании сывороток крови животных в одном разведении
3.5 Комиссионное испытание «Набора препаратов для выявления антител к бактериям Moraxella bovis методом иммуноферментного анализа (ИКК-СЕРОТЕСТ)»
3.6 Производственные испытания «Набора препаратов для выявления антител к бактериям Moraxella bovis методом иммуноферментного анализа» (ИКК-СЕРОТЕСТ)
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
ВЫВОДЫ
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЯ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АГ-АТ - антиген-антитело
БСА/ЛСА - сывороточный альбумин быка/лошади ИКК - инфекционный кератоконъюнктивит ИФА - иммуноферментный анализ КББ - карбонатно-бикарбонатный буфер КМПА - кровяной мясопептонный агар КРС - крупный рогатый скот
М.К. - микробные клетки
МПА - мясопептонный агар
МПБ - мясопептонный бульон
МПЖ - мясопептонная желатина
ОП490 - оптическая плотность
ОФД - ортофенилдиамин
ПМПА - полужидкий мясопептонный агар
РА - реакция агглютинации
РДП - реакция диффузионной преципитации
РСК - реакция связывания комплимента
Т - титр
ТСА - триптон-соевый агар
ТСБ - триптон-соевый бульон
ТХУ - трихлоруксусная кислота
УФ - ультрафиолетовый
ФБР - фосфатно-буферный раствор
ФСБР/т. - фосфатно-буферный раствор с Твином
шт. — штамм
Ферментные метки обладают чрезвычайно мощным каталитическим действием, одна молекула фермента может реагировать с большим количеством молекул субстрата. Таким образом, фермент, присутствующий в ничтожных количествах, можно выявить и количественно определить по образованию продуктов, катализируемой им реакции. Другое преимущество применения ферментов в качестве меток обусловлено наличием в молекуле многочисленных функциональных групп (сульфгидрильных, карбоксильных, остатков тиразина и др.), через которые можно ковалентно присоединить молекулы лиганда.
Ферментные маркеры, используемые в ИФА, должны обладать следующими свойствами:
- высокая активность'-и-стабильность фермента в условиях анализа, при модификации и в конъюгате с антителами или другими белками;
- наличие чувствительных субстратов и простота метода определения продуктов или субстратов ферментативной реакции;
- возможность адаптации субстратных систем к дальнейшему усилению;
- отсутствие фермента и его ингибиторов в исследуемой биологической жидкости (Хаитов Р.М., 2009).
В ИФА может использоваться не менее 15 различных ферментов. Наибольшее применение, в соответствии с вышеназванными требованиями, нашли пероксидаза хрена (ПХ), щелочная фосфатаза (ЩФ) и (З-Б-галактозидаза. Все три фермента стабильны и катализируют высокочувствительные реакции. Кроме того, продукты, получаемые в результате реакций, катализируемых этими ферментами, в зависимости от используемого субстрата, могут выявляться не только колориметрическими методами, но также флуоресцентными методами. Другие ферменты используются значительно реже. Это объясняется их более низкой в сравнении с ПХ и ЩФ удельной активностью (Сотников Д.В., 2006).
В зависимости от подхода к измерению результата реакции выделяют неконкурентный и конкурентный ИФА.
Если на первой стадии в системе присутствует только определяемый реагент: антиген или антитела, то метод является неконкурентным.