Разработка липосомальной лекарственной формы противомеланомной вакцины

• Автор: Михайлова, Татьяна Витальевна
• Шифр специальности: 14.04.01
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 99 с. : 16 ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список сокращений

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Биотерапия опухолей

1.2. Меланома - клиническая и иммунологическая характеристика

1.3 .Характеристика белков теплового шока Нэр-

1.4. Липосомальные вакцины

1.5.Технологические этапы получения липосомальных препаратов

1.5.1. Методы получения многослойных липосом

1 .б.Сушка липосомальной дисперсии

1.7.Методы стерилизации липосомальных вакцин
1.8.Контроль качества липосомальных препаратов
1.8.1. Определение размеров липосом
1.8.2.Количественное определение включенного вещества в липосомы
1.8.3. Определение степени окисления липидных компонентов
1.9. Исследование иммунного ответа методом ЕЫБро!
Заключение по обзору литературы и постановка проблемы
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Материалы и реактивы
2.2. Оборудование
2.3. Клеточные линии и их культивирование
2.3.1. Условия криоконсервации и создание банка клеточных культур
2.3.2. Определение жизнеспособности и роста клеток
2.4. Методы получения опухолевого лизата
2.4.1. Получение опухолевого лизата
2.4.2. Определение концентрации белка в опухолевом лизате
2.5. Определение степени экспрессии НБР-

2.5.1. Постановка электрофореза
2.5.2. Метод иммуноблот
2.6. Получение многослойных липосом
2.7. Методика определения размера липосом
2.8. Определение структуры липосом методом электронной микроскопии
2.9. Определение эффективности включения лизата в липосомы
2.10. Методика количественного определения белка в липосомах
2.11. Определение степени окисления липидных компонентов
2.12. Определение остаточных количеств органических растворителей (хлороформ)
2.13. Биологические методы изучения противоопухолевой активности липосомальной вакцины
2.13.1. Оценка числа ИФН-гамма-продуцирующих лейкоцитов методом ЕПвро!
2.14. Статистическая обработка данных
ГЛАВА 3. ОЦЕНКА ЭКСПРЕССИИ Н8Р-70 НА КЛЕТОЧНЫХ ЛИНИЯХ МЕЛАНОМЫ ЧЕЛОВЕКА
3.1. Изменение уровня Изр-70 в зависимости от воздействия на клетки меланомы человека
3.2. Сравнение экспрессии Й8р70 с экспрессией НЬА-АВ и НЬА-011 на клеточных линиях меланомы человека
Выводы по третьей главе
ГЛАВА 4. РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ И ЛИОФИЛИЗАЦИИ ЛИПОСОМАЛЬНОЙ ДИСПЕРСИИ
4.1. Разработка состава липосомальной лекарственной формы противомеланомной вакцины
4.1.1. Выбор оптимального молярного соотношения липидных компонентов при разработке ЛЛФПВ
4.1.2. Выбор оптимального соотношения суммы липидов и лизата при
разработке ЛЛФПВ
4Л .3. Разработанная методика получения ЛЛФПВ
4.1.4. Методика получения пустых липосом
4.2. Выбор режима замораживания и процесса сушки
4.3. Выбор криопротектора
4.3.1. Изучение влияния криопротекторов на размер липосом в процессе лиофилизации
4.3.2. Изучение влияния криопротекторов на эффективность включения лизата в липосомы после лиофилизации
4.4. Разработка химико-фармацевтических методик для контроля качества ЛЛФПВ-лио
4.4.1. Применение метода иммуноблот для качественного анализа ЛЛФПВ-лио
4.4.2. Методика определения эффективности включения лизата в липосомы после лиофилизации
4.4.3. Применение метода ТСХ для качественного анализа ЛЛФПВ-лио
4.5. Оценка физико-химических показателей липосомальной вакцины после стерилизации гамма-облучением
4.5.1. Выбор дозы гамма-облучения лиофилизированной липосомальной вакцины
4.5.2. Анализ образцов липосомальной вакцины после гамма-облучения в микробиологической лаборатории
4.5.3. Оценка физико-химических показателей липосомальной вакцины
после гамма-облучения
4.5.3.1 .Форма и структура липосом
4.5.3.2.0пределение степени нагрузки лизата в липосомы
4.5.3.3. Определение продуктов деградации лецитина с 2-тиобарбитуровой
кислотой после гамма-облучения
4.5.4.0ценка уровеня Ьзр-70 в ЛЛФПВ после стерилизации

При проведении контроля качества липосом использованы следующие реактивы:
Гель на основе декстрана — Sephadex G-200 superfine (Amersham Biosciences, Швеция);
Спирт этиловый 95%, ФС 42-3072-94;
Йод кристаллический (ч.д.а) ГОСТ 4159-79;
Натрия хлорид (ч.) ГОСТ 4233-77;
Н - бутанол ГОСТ 606 -78;
Серебра нитрат ГОСТ 1277-75;
Метанол (LAB - SCAN);
Аммиак концентрированный ГОСТ 3769 - 78;
Ледяная уксусная кислота (х.ч.) ГОСТ 61-75.
При изучении эффективности липосомальной формы
противомеланомной вакцины использованы следующие материалы и реактивы:
2.2. Оборудование
- Роторный испаритель с водяной баней «BÜCHI Rotavapor R-200», Г ермания;
- Инвертированный световой микроскоп DMIL (Leica Microsystems, Г ермания);
- Инвертированный световой микроскоп Nikon Eclipse TE2000-U, Япония);
- Просвечивающий электронный микроскоп JEM-IOOS JEOL (Япония)
- Спектрофотометр Caiy 100 Scan (Varian, Австралия);
- Спектрофотометр СФ-46 (ЛОМО, Россия);
- Целлюлозные фильтры Millipore (США);
- Весы Sartorius LA 1200 S (Sartorius AG, Германия);
- pH-метр Sartorius PP-15 (Sartorius AG, Германия);