Разработка метода экспресс-диагностики перинатальных инфекций на основе количественной оценки содержания ДНК бактерий, колонизирующих организм плода и новорожденного

• Автор: Дегтярева, Лидия Андреевна
• Шифр специальности: 14.03.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 98 с. : 11 ил.

Содержание:
Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Роль инфекционной патологии в неонатальной практике

1.2 Этиология неонатальных инфекций

1.3 Характеристика некоторых патогенов

1.4 Диагностика неонатальных инфекций

Глава 2. Материалы и методы

2.1 Культивирование штаммов бактерий

2.2 Микробиологические методы, использованные для выделения бактерий из клинического материала

2.3 Выделение геномной ДНК из штаммов бактерий

2.4 Выделение геномной ДНК из бактериальных культур и клинических образов
2.5 Дизайн и синтез олигонуклеотидных праймеров и зондов Тацтап
2.6 Мультиплекс-ПЦР в режиме реального времени
2.7 Молекулярное клонирование
2.8 Изучение специфичности разработанной тест-системы
2.9 Статистическая обработка полученных результатов
Глава 3. Собственные результаты
3.1 Дизайн олигонуклеотидных праймеров и зондов Тацгпап
3.2 Оценка специфичности, аналитической чувствительности тест-системы, а также достоверности количественной детекции ДНК
3.3 Получение рекомбинантных плазмидных ДНК для использования
в качестве калибраторов и внутреннего контроля ПЦР
3.4 Сравнение различных методов выделения бактериальной геномной ДНК

3.5 Оценка диагностической чувствительности и специфичности разработанной тест системы
Глава 4. Обсуждение полученных результатов
Выводы
Практические рекомендации
Список литературы

Введение
Актуальность.
Одной из наиболее актуальных и сложных проблем современной перинатологии являются инфекционные заболевания [7, 26, 33]. Ключевыми бактериальными патогенами, вызывающими неонатальные инфекции, являются Escherichia coli, Klebsiella spp., Streptococcus agalactiae, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes и Lysteria monocytogenes [1,38].
Успешное разрешение проблемы перинатальных инфекций, как в их предупреждении, так и в патогенетически оправданном и своевременном лечении, зависит от использования эффективных диагностических и лечебных технологий. В связи с чрезвычайно высокой скоростью развития инфекционного процесса у новорожденного ребенка, особую значимость в неонатальной клинике приобретают методы микробиологической экспресс-диагностики. В настоящее время спектр диагностических возможностей для выявления перинатальных инфекций значительно расширился. В частности, в существующих программах по раннему выявлению инфекций у новорожденных, большое значение придается серологической диагностике, прежде всего для выявления вирусных инфекций [10].
В то же время, существующие методы не всегда оказываются достаточно чувствительными для выявления патогенных микроорганизмов. В большей степени это относится к бактериальным патогенам, для обнаружения которых в основном используются традиционные микробиологические методы, характеризующиеся длительным временем получения результата, высокой трудоемкостью и высокой зависимостью интерпретации результатов от квалификации лабораторного персонала [2].
В связи с этим в последние годы отдается предпочтение методам, основанным на эффектах ДНК-гибридизации и амплификации нуклеиновых кислот. Прежде всего, речь идет о методах, в основе которых лежит полимеразная цепная реакция (ГТЦР). Эти методы отличаются высокой
чувствительностью и специфичностью, позволяют обнаруживать присутствие микроорганизмов в микроколичествах исследуемого материала за короткое время [3, 4, 8, 83]. В качестве объекта исследования может быть использован любой биологический материал. Современные модификации этого метода, в первую очередь мультипраймерная ПЦР в режиме реального времени, позволяют проводить не только одновременное качественное определение присутствия нескольких патогенных микроорганизмов в исследуемом материале, но и устанавливать их количественное содержание [61].
В настоящее время в России не представлено ни одной тест-системы для одновременного определения методом мультипраймерной ПЦР в режиме реального времени бактерий S. agalactiae, E. coli, Klebsiella spp., являющихся основными патогенами в неонатологической практике. Разработка и внедрение в практику подобной тест-системы позволит существенно сократить время постановки диагноза и назначения этиотропной антибактериальной терапии новорожденным в отделениях интенсивной терапии и реанимации.
Цель исследования:
Разработать диагностическую тест-систему, обеспечивающую одновременную экспресс-диагностику инфекционных заболеваний, вызванных Streptococcus agalactiae, Escherichia coli и Klebsiella spp., у плодов и новорожденных детей путем количественной детекции геномной ДНК указанных возбудителей методом ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ).
Задачи исследования:
1. Подобрать нуклеотидные последовательности праймеров и
флуоресцентных зондов для детекции S. agalactiae, E. coli и Klebsiella spp.

количественная детекция. Массивная клеточная стенка гамположительных бактерий резистентна к лизису детергентами и хаотропными солями, и препятсвует высвобождению ДНК из клеток при лизисе кипячением. Это приводит к необходимости добавления дополнительных этапов обработки образца, направленных на разрушение пептидогликана с целью количественной экстракции и детекции ДНК. Поэтому сохраняется необходимость в поиске нового более пригодного метода выделения геномной ДНК из грамположительных бактерий.
Таким образом, к настоящему времени, внедрение новых методов диагностики основанных на молекулярных технологиях уже привело к изменению способов выявления наследственных заболеваний человека и инфекционных заболеваний, прежде всего вызываемых вирусами. Использование методов выявления и идентификации наиболее важных патогенных микроорганизмов бактериальной и вирусной природы, основанных на использовании массива молекулярных технологий, становится сегодня обычным направлением в лабораторной практике.
Методы, основанные на молекулярно-генетических технологиях отличаются высокой чувствительностью и специфичностью, а также позволяют обнаруживать присутствие микроорганизмов в микроколичествах исследуемого материала и за короткое время. Именно поэтому особую значимость приобретает применение их в диагностике неонатальных инфекций.
В настоящее время существует большое количество коммерчески доступных тест систем для обнаружения возбудителей неонатальных инфекций, но большинство из них направлено на выявление всего одного патогена. В то время как спектр микроорганизмов, способных вызывать инфекции у новорожденных, достаточно широк. В неонатальной практике высока роль таких инфекционных агентов как E.coli, К. pneumonia, S. agalactiae, L.monocytogenes, S.aureus, а также ЦМВ и ВПГ. Из предложенных