Тонкое генетическое картирование локуса МНС, контролирующего уровень восприимчивости и иммунный ответ мышей при инфекции, вызванной Mycobacterium tuberculosis

• Автор: Коротецкая, Мария Валерьевна
• Шифр специальности: 14.03.09
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 85 с. : ил.

Оглавление
1. Введение
1.1. А ктуалъность темы
1.2. Цель и задачи исследования
1.3. Научная новизна
1.4. Практическая значимость работы
2. Обзор литературы
2. 1. Введение
2.1.1. Генетический контроль туберкулезной инфекции
2.2. Генетика туберкулеза человека
2.2.1. Общие положения
2.2.2. Гены, контролирующие восприимчивость к туберкулезу у человека
2.2.3. Генетика экспериментального туберкулеза
2.2.3.1. Общие положения
2.2.3.2.Два подхода к исследованию генетики туберкулеза на мышах
2.2.3.3. Гены, участвующие в контроле туберкулеза у мышей, выявленные методом «обратной генетики»
2.2.3.4. Ген xid (btk)
2.2.3.5 Гены предрасположенности к туберкулезу у мышей, выявленные методом «прямой генетики»
2.2.3.5.1. Ген Sellai (по старой номенклатуре Nrampl)
2.2.3.5.2. Ген Iprl
2.2.3.5.3 Локусы Trl-1, Trl-2, Trl-3 uTrl-
2.2.3.5.4. QTL на 3, 9 и 17 хромосомах
3. Материачы и методы
3.1. Животные и выведение рекомбинантных конгенных линий мышей
3.2. Выделение ДНК
3.3. Генетическое типирование
3.4. Заражение и параметры инфекции
3.5. Подсчет колоний микобактерий (CFU)
3.6. Приготовление суспензии легких и проточная цитофлуориметрия
3.7. Продукция цитокинов
3.8. Гистологические исследования
3.9. Постановка пролиферативного теста

3.10. Выделение РНК и получение кДнк
3.11. Определение экспрессии генов методом ПЦР в реальном времени
3.12. Клонирование генов-кандидатов
3.13. Определение экспрессии генов с помощью ДНК-микрочипов Illumina
3.14. Статистическая обработка результатов
4. Результаты
4.1. Выведение новых рекомбинантных линий мышей конгенных по МНС
4.2. Локус tbs-З влияет на разные фенотипы
4.3. Исследование роли полиморфизма TNF-a в течении инфекции
4.4. Тонкое генетическое картирование участка МНС, содержащего ген-кандидат
4.5. Генотипические и фенотипические характеристики новой линии B6.I-9.5.
4.6. Исследование клеточного состава легких при инфекции
4.7. Линия мышей В6 несет доминантный аллель, определяющий резистентность к инфекцииЫ
4.8. Анализ экспрессии генов в нормальной и зараженной легочной ткани линий
4.9. Сужение области генома, несущей ген(ы) -кандидат(ы)
4.10. Сравнение параметров течения ТБ у мышей линий В6.1-249.1.15.100 и родительских линий
4.11. Позиционное клонирование в области 17:34,243371 - 34,341
5. Обсуждение
6. Выводы
7. Список сокращений
8. Список литературы
1. Введение
1.1. Актуальность темы
Многочисленные исследования последних лет ясно показали, что уровень восприимчивости к инфекции и тяжесть течения заболевания во многом определяются генетическими особенностями хозяина и что контроль взаимодействия «паразит-хозяин» при туберкулезе носит полигенный характер (Апт A.C., Кондратьева Т.К. 2008; Apt AS. 2011; Schurr E., Kramnik I. 2008). При этом, до сих пор немногое известно о конкретных генах, предопределяющих восприимчивость к туберкулезу (ТБ) и о физиологических (иммунологических) фенотипах, которые они контролируют.
Генетический контроль ТБ со стороны хозяина во всем мире изучается лишь несколькими группами исследователей, поэтому наши представления о генетике восприимчивости и тяжести течения туберкулеза, как и других комплексных хронических заболеваний, очень скудны. Каждое новое сочетание родительских линий мышей (Mitsos L. М. et al. 2000; Sanchez F. et al. 2003; Yan B.S. et al. 2006), каждая новая обследованная популяция людей (Sahiratmadja E. et al. 2007; Lee H.W. et al. 2005; Tso H.W. et al. 2005; Bellamy R. et al. 1999; Liu W. et al. 2004) приносит сведения о ранее не подозревавшихся механизмах контроля и генах-участниках. Лишь в самое последнее время было впрямую показано, насколько важным в прогностическом аспекте может оказаться сочетание генетического картирования с исследованием регуляции иммунного ответа при хронических воспалительных состояниях (Lee J.C. et al. 2013), и это в полной мере относится к генетическому контролю тяжести течения ТБ. Идентификация новых локусов и генов позволит получить новые знания о механизмах регуляции процессов, задействованных в контроле ТБ инфекции.
1.2. Цель и задачи исследования
Целью настоящего исследования было точное картирование (сужение) генетической области в комплексе Н2, несущей ген(ы), ответственный(е) за тяжесть течения туберкулезной инфекции (локус tbs-3 = tuberculosis sensitivity-З), и поиск регуляторных механизмов работы иммунной системы у мышей с генетически детерминированными различиями по чувствительности к ТБ. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

3.11. Определение экспрессии генов методом ПЦР в реальном времени
Для проведения ПЦР в реальном времени мы использовали систему количественной идентификации ПЦР-продукта по связыванию с интеркалирующим красителем SYBR Green I. Последовательности праймеров для интересующих нас генов были подобраны с учетом следующих требований: величина Тт праймеров составляла 60°-61°С, ампликон для всех исследуемых генов составлял 150-160 пар оснований, праймеры не должны были образовывать вторичные структуры и быть комплементарными к друг другу. Кроме того forward- и reverse-праймеры были комплементарны последовательностям разных экзонов гена. В качестве «housekeeping» гена использовали Р-актин, экспрессию которого определяли с праймеров ActbF 5’-CACCTTCTACAATGAGCTGC-3’ и ActbR 5 ’-СТ GG AT GGCT ACGT АС AT GG-3 ’. Для экспрессии генов Ring и Wdr46 использовали праймеры: RingF 5’-
GAGATTGAGCTTGTGTTCCG-3’, RingR 5’-CTGTGGTTTCCTGCTGCTG-3’h Wdr46F 5’-TGGCGAAGATTCTGTGTCAC-3’, Wdr46R 5 ’ -C AAGGTCCGGG A ACTC AG-3 ’
соответственно. Для проведения ПЦР в реальном времени использовали готовую реакционную смесь (Maxima SYBR Green qPCR Master Mix, Fermentas), ДНК-полимеразу Taq (Хеликон, Россия), кДНК в разведениях и праймеры, подобранные для интересующих нас генов. Использовали не менее 3-х образцов кДНК для каждой точки. В качестве контролей были использованы лунки не содержащие матрицы и образцы без обратной транскриптазы (RT-). Реакцию ПЦР проводили в амплификаторе CFX96 Real Time System (Bio-Rad), используя следующий протокол: 95°С - 5 мин; 39 циклов: 95°С -15 сек, 60°С - 40 сек. Поскольку для детектирования ампликонов использовали SYBR Green, который связывается с любой двухцепочечной ДНК, присутствие неспецифических продуктов могло приводить к увеличению сигнала. Поэтому продукты дополнительно анализировали и строили кривые плавления. Для обработки результатов использовали относительный пороговый метод (threshold method).
3.12. Клонирование генов-кандидатов
Поскольку последовательность генома линии мышей I/St до сих пор не установлена, и последовательности генов не известны, для синтеза праймеров использовали последовательности генов мышей В6, которые брали из базы данных Ensembl [179]. Для клонирования использовали праймеры длиной 21-25 нуклеотидов и для обеспечения лучшей комплементарности с последовательностью генов линии мышей I/St, forward-праймер заканчивали старт-кодоном ATG, а reverse-праймер стоп-кодоном