Создание иммунохимических реагентов для выявления CagA-антигена HELICOBACTER PYLORI и антител против него

• Автор: Климович, Александр Владимирович
• Шифр специальности: 14.03.09
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 129 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Эпидемиология инфекции Н. pylori

1.2. Факторы патогенности Н. pylori

1.3. Молекулярная структура белка CagA

1.4. Биологические эффекты CagA

1.5. Иммунный ответ на инфекцию Н pylori

1.6. Диагностика инфекций Н. pylori

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Клонирование фрагментов гена cagA
2.2. Создание штаммов-продуцентов рекомбинантных белков
2.3. 11аработка и очистка рекомбинантных белков
2.4. Молекулярно-генетическое типирование изолятов Н. pylori
2.5. Иммунизация мышей и создание гибридом
2.6. Иммунохимические методы исследования
2.7. Статистическая обработка результатов
3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. In silico анализ последовательностей белков CagA
3.2. Клонирование фрагментов гена cagA и их анализ
3.3. Экспрессия и очистка рекомбинантных фрагментов CagA
3.4. Использование rCagAfr. 1-3 для выявления сывороточных антител
3.5. Получение и характеристика МКАТ
3.6. Молекулярно-генетическое типирование Н. pylori
3.7. Разрабо гка двухцентрового ИФА
4. ОБСУЖДЕНИЕ
ВЫВОДЫ
БЛАГОДАРНОСТИ
ЦИТИРОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
А.к.о. - аминокислотный остаток БСА — бычий сывороточный альбумин
ГАТ — ростовая среда, обогащенная гипоксантином, аминоптерином и тимидином
ГТ — ростовая среда, обогащенная гипоксантином и тимидином
ДСН - додецилсульфат натрия
Ед. - единица активности фермента
ИИ - индекс ингибирования
ИПТГ - изопропил-бета-Б-тиогалактозид
ИФА - иммуноферментный анализ
ЛПС — липополисахарид
МКАТ - моноклональное антитело
НАФ — неполный адъювант Фрейнда
ОП - оптическая плотность раствора
П.н. - пара нуклеотидов
П ААГ — полиакриламидный гель
Г1АФ - полный адъювант Фрейнда
ПЦР — полимеразная цепная реакция
ПЭГ - нолиэтиленгликоль
СКРС — сыворотка крови крупного рогатого скота TCP - трис-солевой раствор ТМБ - тетраметилбензидин ФСР - фосфатно-солевой раствор
DMEM - минимальная ростовая среда Игла в модификации Дульбекко E. coli - Escherichia coli
EPIYA - последовательность Glu-Pro-Ile-Tyr-Ala
H. pylori - Helicobacter pylori
MALT-лимфома- рак лимфоидной ткани, ассоциированной со слизистыми pY-CagA - фосфорилированная форма белка CagA T4SS - секреторная система IV типа 6xHis - гексагистидиновый мотив
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы
Иммулохимические методы анализа приобретают всё большее значение в диагностике инфекционных заболеваний человека. Они позволяют выявлять антигены возбудителя, характеризовать его фенотип и патогенетический потенциал, а также оценивать иммунный ответ организма и исследовать его механизмы.
Инфекция бактерией Helicobacter pylori вызывает развитие в слизистой желудка воспалительного процесса, который в большинстве случаев протекает в форме хронического гастрита. В ряде случаев (до 20%) инфекция приводит к возникновению острого гастрита, язвенной болезни, аденокарциномы желудка и MALT-лимфомы (Жебрун, 2006; Küsters et al.. 2006). Наиболее выраженные патологические процессы, сопряженные с повышенной вероятностью опухолевой трансформации, вызывают штаммы II. pylon, экспрессирующие цитотоксин CagA (Hatakeyama, Higashi, 2005). Этот белок признан одним из основных факторов патогенности Н. pylori и считается ответственным за нарушение целостности эпителия слизистой желудка, индукцию неконтролируемой пролиферации эпителиальных и лимфоидных клеток, секреции провоспалительных цитокинов и модуляцию презентации антигенов клетками эпителия (Brandt et al., 2005; Hatakeyama, 2008; Costa et al., 2009). Цитотоксин CagA является вариабельным белком, и в популяции носителей инфекции II. pylori циркулируют штаммы бактерии, экспрессирующие CagA-белок «западного» или «восточноазиатского» типов, которые различаются по аминокислотной последовательности и биологической активности (Xia et al., 2009).
Инфекции CagA-позитивными штаммами II. pylori сопряжены также с развитием ряда экстрагастральныч заболеваний аутоиммунной природы. Антитела против CagA-белка вносят существенный вклад в патогенез иммунной громбоцигопении (Franceschi et al., 2004; Takahashi et al., 2004). Роль и молекулярные механизмы участия цитотоксина CagA и антител против него в патогенезе других аутоиммунных заболеваний (хроническая уртикария, аутоиммунный тироидит и др.) нуждаются в дальнейшем исследовании (Figura et al., 1999; Bakos, Hillander, 2003; Stasi, Provan, 2008).
До сих пор остаются неизученными свойства CagA-белка как антигена: не выяснена иммуногенность различных эпитопов молекулы, не исследован изотопический спектр антител, вырабатываемых против этого белка.
По заключению ряда экспертов, в том числе III Маастрихтской конференции, для диагностики инфекции II. pylori рекомендуется использовать комплекс иммунологических и молекулярно-биологических методов (Malfertheiner et al., 2007; Mishra et al., 2008;

низкую специфичность и чувствительность (75-90%), биохимические методы, и> в. особенности, дыхательный уреазный тест, широко используются в рутинной диагностической практике, а также при масштабных эпидемиологических исследованиях (Gisbert, Pajares, 2004а; Malfertheiner et al., 2007; Selgrad et al., 2009).
Недостатки и ограничения бактериологических и биохимических методик стимулировали развитие молекулярно-генетического подхода в диагностике инфекций
H. pylori. Методы выявления ДНК H. pylori в биоптате всё шире входят в клиническую практику, поскольку гесгы, основанные на полимеразной цепной реакции (ПЦР) характеризуются очень высокой чувствительностью и> специфичностью. Неоспоримым преимуществом этого метода является возможность не только детекции патогена, но и оценки его вирулентного потенциала. В частности, с помощью ПЦР возможно тииировать
H. pylori по генам, определяющим патогенность (vacA и ccigA), а также выявлять устойчивость изолята к антибиотикам (Selgrad et al., 2009). В эпидемиологических исследованиях молекулярно-генетическое типирование штаммов H. pylori позволяет оценивать темпы генетической диверсификации бактерий и анализировать пути передачи патогена (Gunn et al, 1998; Bolek ei al., 2007; Megraud, Lehours, 2007). Молекулярногенетические методы.диагностики H. pylori демонстрируют высокую информативность и точность при анализе биопсийного материала, тогда как использование этих методов при неинвазивной диагностике H. pylori, напротив, в большинстве случаев себя не оправдывает. В крови бактериальная ДНК обнаруживается лишь при сильно выраженном патологическом процессе, а амплификация фрагментов ДНК из стула оказывается часто неэффективной из-за наличия примесей, ингибирующих ПЦР (Vaira, Vakil, 2001; Ricci et al., 2007).
Серологические методы диагностики инфекции H. pylori вошли в практику одними из первых, поскольку было давно установлено, что инфекция вызывает постоянную продукцию антител к белкам Н. pylori (Jones etui., 1984; Graessle et al, 1999). Тем ие менее, длительное время этой группе методов не придавали существенного значения, поскольку их чувствительность и специфичность оставались крайне низкими. Основной причиной низкой специфичности и чувствительности было использование в качестве антигенов тотальных лизатов культур Н. pylori. Вследствие этого, с одной стороны, на результатах тестов существенно сказывалась перекрестная реактивность антител в сыворотках. Так, например, антитела к флагеллину (консервативному белку жгутиков различных бактерий) в сыворотке здоровых пациентов реагировали с антигенами в лизатах Н. pylori и, таким1 образом, давали ложно-позитивный сигнал и приводили к