Фармакологическая коррекция гестоза L-аргинином при моделировании дефицита оксида азота в эксперименте

• Автор: Барсук, Анна Александровна
• Шифр специальности: 14.03.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Курск
• Количество страниц: 82 с. : 38 ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О ПАТОГЕНЕЗЕ ГЕСТОЗА
(ПРЕЭКЛАМПСИИ) (обзор литературы)
1Л Эндотелиальная дисфункция и преэклампсия
1.2Потенциальные медиаторы эндотелиальной дисфункции
1.3. Роль АЕ)МА в развитии преэклампсии
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Моделирование Ь-МАМЕ-индуцированного гестоза и оценка эндотелийза-висимых и эндотелийнезависимых сосудистых реакций
2.2. Биохимические маркеры эндотелиальной дисфункции
2.3. Оценка плацентарной микроциркуляции
2.4. Сбор суточной мочи и оценка протеинурии
2.5. Морфологические методы оценки сердечнососудистых изменений в почках и плаценте при моделировании Г-ИАМЕ-индуцированного гестоза..
2.6. Обоснование доз и дизайн эксперимента
2.7. Статистическая обработка
ГЛАВА. 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. Разработка комплекса методических подходов для количественной оценки развития гестоза у беременных крыс при Ь-ИАМЕ-индуцированной модели дефицита N0 в эксперименте с использованием результатов функциональных проб, биохимических маркеров и результатов морфологических исследований
3.2. Исследование эффективности Ь-аргинина при Ь-ЫАМЕ-индуцированном гестозе
3.3. Исследование эффективности амлодипина при Ь-УАМЕ-индуцироваипом гестозе
3.4. Исследование эффективности сочетанного применения Ь-аргинина и амлодипина при Ь-ИАМЕ-индуцированном гестозе
3.5 Интегральный векторный анализ комплексной оценки протективных эффектов Ь-аргинина и амлодипина при моделировании Ь-ИАМЕ-индуцированного гестоза
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АГ - артериальная гипертензия
АцХ - ацетилхолин
АТФ - аденозинтрифосфат
ИБС - ишемическая болезнь сердца
ЛЖД - левожелудочковое давление
+dp/dt — максимальная скорость увеличения левожелудочкового давления
- dp/dt — максимальная скорость снижения левожелудочкового давления NO - оксид азота
L-NAME - метиловый эфир N-нитро-Ь-аргинина
эд - эндотелиальная дисфункция
чсс - частота сердечных сокращений
КЭД - коэффициент эндотелиальной дисфункции
eNOS - эндотелиальная NO-синтаза
L-NMMA - № -монометил-Ь-аргинин
NOS - NO-синтаза
Total NO - концентрация стабильных метаболитов оксида азота VEGF - фактор роста эндотелия сосудов ADMA-ассиметричный диметиларгинин

ВВЕДЕНИЕ
Эндотелиальные клетки сосудистого русла, осуществляя синтез локально действующих медиаторов, морфофункционально ориентированы на оптимальное регулирование органного кровотока [4]. Оксид азота (N0) - ведущий гуморальный эндотелиальный модулятор дилятации, релаксирующий сосуды. Общая масса эндотелия у человека колеблется в пределах 1600-1900 г, что даже больше массы печени. Поскольку клетки эндотелия выделяют большое количество различных веществ в кровь и окружающие ткани, поэтому их комплекс можно рассматривать как самую большую эндокринную систему [11,23].
В патогенезе и клинике гестоза, артериальной гипертонии, атеросклероза, сахарного диабета и их осложнений одним из важных аспектов считается нарушение структуры и функции эндотелия. При этих заболеваниях он предстает в роли первоочередного органа мишени, поскольку эндотелиальная выстилка сосудов участвует в регуляции сосудистого тонуса, гемостаза, иммунного ответа, миграции клеток крови в сосудистую стенку, синтезе факторов воспаления и их ингибиторов, осуществляет барьерные функции [50,63,134].
Как известно N0 синтезируется из Ь-аргинина под влиянием МО-синтазы путем присоединения молекулярного кислорода к конечному атому азота гуанидиновой группы Ь-аргинина [103,121].
Несмотря на то, что в патогенезе преэклампсии обнаружено множество компонентов, в последние годы наибольшее внимание уделяется эндотелиальной дисфункции [7, 18]. Плацентарная ишемия приводит к высвобождению многочисленных плацентарных факторов, которые оказывают серьёзное влияние на кровоток и регуляцию сосудистого русла [139]. Эти факторы включают в себя рецептор-1 растворимого фактора роста эндотелия сосудов (УЕОР) (бРИ-1) [117,140], аутоантитело рецептора ангиотензина II (тип 1) (АТ1-АА) [57,74] и цитокины (фактор некроза опухоли (ТЬЛ^-а) [161,162], которые по очереди формируют масштабную дисфункцию эндотелия материнских сосудов [134]. Эта дисфункция проявляется в качестве усиленного образования таких факто-

ков-метчиков с диапазоном молекулярной массой (М.м.) 7000-200000 Да (Bio-Rad Kaleidoscope Prestained Standards, USA), что позволяло идентифицировать полосу, соответствующую eNOS (М.м. которой 140000 Да). Белок в клеточном лизате определяли по методу Lowry с использованием БСА в качестве стандарта.
По окончании электрофореза осуществляли перенос белков с геля на нит-роцеллюлозную мембрану - Вестерн-блот (60 В, 1 час) (ссылка). Эффективность переноса определяли с помощью обратимого окрашивания мембран белковым красителем Ponceau Red (Sigma, USA). После трёхкратной отмывки мембраны 5 мМ фосфатным буфром pH 7,4, содержащим 150 мМ NaCl и 0,05 % твина-200, её в течение ночи обрабатывали раствором поликлональных кроличьих антител против eNOS человека (BD Transduction Labs, USA), разведённых (в соотношении 1:500) в 5 мМ фосфатном буфере, pH 7,4, содержащем 0,1% азида натрия. Затем мембрану отмывали 7 раз по 10 мин в том же буфере. В течение часа мембрану инкубировали с разведёнными в соотношении 1:300 вторыми антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена (goat anti-rabbit IgG antibodies,Sigma, USA). При этом неспецифическое связывание коньюгатом блокировали добавлением в буфер 5% обезжиренного сухого молока. Затем мембрану снова отмывали в фосфатном буфере (7 раз по 10 мин).
еЫОЗ, 140 Ша

Рисунок 2.1 Детекция полосы еМЭБ
Детекцию полосы еЖ)8 проводили методом усиленной хемолюминесценции (ЕСД)(Рис 2.1). После отмывки в фосфатном буфере 7 раз по 10 мин мембрану обрабатывали соответствующим раствором (ЕСХ, АтегэИат), как указано производителем, экспонировали на плёнку Нурегіїїт-ЕСЕ (Атег-вІїатДЖ) в течение 2 ч в темноте. Полоску, соответствующую еМ38 детектировали в соответствии с её молекулярной массой, устанавливаемой по сравне-