Влияние антител к глутамату на экспрессию генов программируемой гибели клеток головного мозга на модели болезни Альцгеймера.

• Автор: Колобов, Виталий Викторович
• Шифр специальности: 14.03.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 113 с. : 28 ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Клинико-морфологические особенности болезни Альцгеймера

1.2 Нейротоксичность глутамата

1.3 Феномен программируемой гибели клеток в нервной ткани

1.4 Роль нейроиммунных взаимодействий в патогенезе болезни Альцгеймера

1.5 Экспериментальные модели болезни Альцгеймера

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Патофизиологические методы исследования

2.1.1 Объекты исследования
2.1.2 Модель экспериментальной болезни Альцгеймера
2.1.3 Условный рефлекс пассивного избегания
2.2 Иммунологические методы исследования
2.2.1 Получение конъюгированного антигена глутамат-белок
2.2.2 Получение антител к глутамату
2.3 Биохимические методы исследования
2.3.1 Выделение белков
2.3.2 Определение концентрации белков
2.3.3 Определение удельной активности каспазы
2.4 Молекулярно-генетические методы исследования
2.4.1 Выделение рибонуклеиновых кислот
2.4.2 Определение концентрации РНК
2.4.3 Удаление примесей геномной ДНК из образцов РНК
2.4.4 Обратная транскрипция
2.4.5 Количественная полимеразная цепная реакция в режиме реального времени
2.4.6 Агарозный гель-электрофорез
2.5 Статистические методы
ГЛАВА 3. ВЛИЯНИЕ ИНТРАНАЗАЛЬНО ВВЕДЁННЫХ АНТИТЕЛ
К ГЛУТАМАТУ НА АКТИВНОСТЬ КАСПАЗЫ-З В ГОЛОВНОМ МОЗГЕ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА
3.1 Особенности активности каспазы-3 в префронтальной коре
3.2 Особенности активности каспазы-3 в гипоталамусе
3.3 Особенности активности каспазы-3 в гиппокампе
3.4 Обсуждение региональных различий ферментативной активности каспазы

ГЛАВА 4. ВЛИЯНИЕ ИНТРАНАЗАЛЬНО ВВЕДЁННЫХ АНТИТЕЛ К ГЛУТАМАТУ НА ЭКСПРЕССИЮ ГЕНОВ ПРОГРАММИРУЕМОЙ ГИБЕЛИ В ГОЛОВНОМ МОЗГЕ ПРИ
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА
4.1 Экспрессия гена СаярЗ в церебральных структурах
4.2 Экспрессия гена А1/т1 в церебральных структурах
4.3 Экспрессия гена Лох в церебральных структурах
4.4 Экспрессия гена в церебральных структурах
4.5 Экспрессия гена Рагр1 в церебральных структурах
4.6 Сравнительный анализ профиля экспрессии генов ключевых эффекторов программируемой гибели в нервной ткани при использовании антител к глутамату
ГЛАВА 5. ЭФФЕКТЫ АНТИТЕЛ К ГЛУТАМАТУ ПРИ НАРУШЕНИЯХ ПАМЯТИ У КРЫС С ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ БОЛЕЗНЬЮ АЛЬЦГЕЙМЕРА
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ
Актуальность исследования. Болезнь Альцгеймера (БА), характеризующаяся нарушением когнитивных функций, снижением памяти и интеллекта, является комплексным мультифакториальным заболеванием, в патогенез которого вовлечено множество процессов, контролируемых значительным числом генов. Среди молекулярно-генетических гипотез, объясняющих развитие БА, амилоидная гипотеза, основанная на индукции бета-амилоидом (Aß) окислительного стресса, является наиболее разработанной [Hardy, Higgins, 1992; Varadarajan et al., 2001; Butterfield, Castegna, 2003; Nunomura et al., 2007]. Aß приводит к ингибированию тканевых окислительных систем [Keller et al., 1998], активации микроглии [Siegel, Zalcman, 2009], запуску эндосомально-лизосомальной сигнальной системы клеток [Cataldo et al., 1996]. При окислительном стрессе происходит структурная модификация белков, приводящая к нейрональной гибели при БА [Castegna et al., 2002; Butterfield, Castegna, 2003].
Механизмы нейрональной гибели, которые ведут к появлению когнитивных нарушений при БА, в настоящий момент находятся на стадии обсуждения, однако ведущую роль в гибели отводят апоптозу [Jellinger, Stadelmann, 2001; Ayala-Grosso et al., 2002; Kermer et al., 2004]. Усиление апоптоза в нервных клетках головного мозга установлено при спорадических и семейных формах БА [Eckert et al., 2003]. Одним из механизмов нейротоксичности ß-амилоидных пептидов является сверхэкспрессия проапоптотического белка Вах [Clementi et al., 2006], увеличенное содержание которого обнаружено в сенильных бляшках в гиппокампе при БА [MacGibbon et al., 1997; Su etal., 1997].
Накопление Aß нарушает протеасомную деградацию и приводит к активации каспаз [Blandini et al., 2006], которые являются эффекторными молекулами как внешнего, так и внутреннего (митохондриального) путей
- - ГГч _ _ 1 ТГ ... ЛАЛ'71 Т-Г _ _ . _ _ . _ 1
структурах головного мозга топографически ассоциируется с

1.5. Экспериментальные модели болезни Альцгеймера
Изучение БА у человека базируется, в основном, на клинических критериях (поведенческие тесты и неврологические шкалы, а также оценка биохимических показателей крови и ликвора) и посмертном морфологическом исследовании отделов головного мозга. Это в сумме позволяет идентифицировать только отдельные стороны патологического процесса и не позволяет установить у индивидуума временную причинно-следственную динамическую связь между различными когнитивньми, биохимическими и морфологическими показателями. В итоге это приводит исследователей к разработке адекватных экспериментальных моделей неврологических и психиатрических заболеваний на животных.
Прогресс в изучении этиологии и патогенеза БА тесно связан с использованием in vitro (на культурах гиппокампальных, корковых или мозжечковых нейронов) и in vivo моделей, в которых удалось экспериментально воспроизвести основные звенья патологического процесса [Woodruff-Pak, 2008; Bugos et al., 2009; Ghorayeb et al., 2011].
Все экспериментальные модели БА в соответствии с методологическим подходом можно разделить на два класса: 1) фармакологические модели, в которых применяют разнообразные фармакологически активные вещества, и 2) трансгенные модели, в арсенал которых входит нокаутирование/выключение определённых генов (или введение мутаций в них; табл. 4), а также РНК-интерференция для точечного снижения экспрессии генов-мишеней.
В зависимости от конкретных целей исследования модельными объектами для экспериментальной БА являются как позвоночные - грызуны (мыши, крысы), приматы, так и беспозвоночные - плодовая мушка Drosophila melanogaster, нематода Caenorhabditis elegans. Беспозвоночные животные, исторически являющиеся классическими объектами молекулярной генетики, обладают, с патофизиологической точки зрения, одним большим недостатком -результаты поведенческих реакций невозможно экстраполировать на человека ввиду иного устройства нервной системы. Однако при работе с D. melanogaster