Разработка и экспериментальное исследование клеточно-инженерной конструкции хрящевой ткани

• Автор: Пономарева, Анна Сергеевна
• Шифр специальности: 14.01.24
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 117 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

§ 1. Хрящевая ткань: структура, функции, повреждения, методы лечения ..Л

1Л. Структура и функии хрящевой ткани

1Л Л. Клеточные элементы хрящевой ткани

1Л .2. Внеклеточный матрикс хрящевой ткани

1Л.З. Виды хрящевой ткани

1.2. Повреждения и способы лечения гиалинового хряща

1.2Л. Клеточные технологии для лечения дефектов хряща

§2. Биодеградируемые полимерные материалы для клеточно-инженерных
конструкций хрящевой ткани
2Л. Гели
2.2. Губки
2.3. Сетки
§3. Мезенхимальные стромальные клетки жировой ткани человека
3.1. Источники получения МСК
3.2. Иммунофенотип МСК жировой ткани человека
3.3. Дифференцировочный потенциал МСК ЖТч
3.3.1. Адипогенная дифференцировка
3.3.2. Остеогенная дифференцировка
3.3.3. Хондрогенная дифференцировка
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
§ 1. Выделение, культивирование и исследование культур МСК ЖТч
1.1. Метод выделения МСК из подкожно-жировой клетчатки человека
1.2. Культивирование МСК ЖТч
1.3. Кривая роста, время удвоения популяции МСК ЖТч
1.4. Исследование колониеобразующей способности МСК ЖТч
1.5. Хромосомный анализ культивируемых МСК ЖТч
1.6. Определение иммунофенотипа МСК ЖТч методом
иммуноцитофлюориметрического анализа
§2. Дифференцировочный потенциал МСК ЖТч условиях in vitro
2.1. Индукция адипогенной дифференцировки
2.2. Индукция остеогенной дифференцировки
2.3. Индукция хондрогенной дифференцировки
2.3.1. Хондрогенная дифференцировка МСК ЖТч в монослое
2.3.2. Хондрогенная дифференцировка МСК ЖТч в 3-D культуре
§3. Определение оптимального состава клеточно-инженерной конструкции хрящевой ткани на основе биополимерного гетерогенного гидрогеля и МСК ЖТч
3.1. Иммобилизация и культивирование МСК ЖТч в биополимерном гетерогенном гидрогеле
3.2. Клеточно-инженерная конструкция хрящевой ткани на основе
биополимерного гетерогенного гидрогеля и МСК ЖТч
§4. Подкожная имплантация клеточно-инженерной конструкции хрящевой ткани на основе биополимерного гетерогенного гидрогеля и не
дифференцированных МСК ЖТч в условиях in vivo
4.1. Подготовка КИК XT для введения лабораторным животным
4.2. Животные и их содержание
4.3. Условия проведения эксперимента
4.3.1. Формирование групп и манипуляции с животными
4.3.2. Исследование биологического материала
4.3.3. Терминальные процедуры
§5. Гистологические и иммуногистохимические методы оценки
5.1. Окрашивание дифференцированной в адипогеном направлении
культуры МСК ЖТч масляным красным О
5.2. Окрашивание дифференцированной в остеогенном направлении
культуры МСК ЖТч ализариновым красным

5.3. Методика приготовления парафиновых срезов
5.4. Окрашивание парафиновых срезов гематоксилином и эозином, альциановым синим и по методу Маллори
5.4.1. Окрашивание парафиновых срезов альциановым синим
5.4.2. Окрашивание парафиновых срезов по методу Маллори
5.5. Окрашивание парафиновых срезов к коллагену II типа
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
§ 1. Характеристика популяций МСК ЖТч
1.1. Выход клеток, морфологическая характеристика МСК ЖТч
1.2. Параметры роста и время удвоения популяций МСК ЖТч
1.3. Колониеобразующая способность МСК ЖТч
1.4. Кариотип культуры МСК ЖТч
1.5. Иммунфенотип культуры МСК ЖТч
§2. Дифференцировочный потенциал МСК ЖТч в условиях in vitro
2.1. Адипогенная дифференцировка
2.2. Остеогенная дифференцировка
2.3. Хондрогенная дифференцировка
2.3.1. Хондрогенная дифференцировка МСК ЖТч в монослое
2.3.2. Хондрогенная дифференцировка МСК в 3-D культуре
§3. Исследование клеточно-инженерных конструкций хрящевой ткани в условиях in vitro
3.1. Иммобилизация и культивирование МСК ЖТч на поверхности биополимерного гетерогенного гидрогеля
3.2. Морфологические изменения КИК хрящевой ткани на основе биополимерного гетерогенного гидрогеля и МСК ЖТч в условиях in vitro...S3 §4. Морфологические изменения КИК хрящевой ткани условиях in vivo (экспериментальная модель подкожной имплантации)
4.1. Интегральные показатели
4.2. Оценка заживления ран

диаметра, которые подражают колагеновым фибрилам во внеклеточном матриксе хряща [72].
Рисунок 8. Электронно-микроскопические снимки матриксов, полученных методом электроспиннинга [72].
§3. Мезенхимальные стромальные клетки жировой ткани человека
Как было уже сказано, метод лечения дефектов хрящевой ткани с помощью АХ обладает рядом недостатков, в числе которых трудность получения достаточного количества клеток и при культивировании in vitro изменение их фенотипа в направлении фибробластной линии и, как следствие, не способность синтезировать хондрогенный ВКМ [33]. Поэтому, в качестве альтернативы данному методу были рассмотрены варианты замены хондроцитов на стволовые клетки [5, 33, 78].
Стволовыми клетками (СК) принято считать неспециализированные клетки, обладающие способностью к самообновлению путем асимметричного деления и дифференцировке в клеточные компоненты различных тканей [75, 76]. Стволовые клетки делят на эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) и стволовые клетки взрослого организма (Рис. 9). Пролиферативный потенциал ЭСК существенно выше, чем у стволовых клеток взрослого организма. Однако чрезмерные плюрипотентность и пролиферативная способность ЭСК требуют тщательного контроля поведения импланта после пересадки из-за повышенной иммуногенности и