Обоснование применения мезенхимальных стволовых клеток, полученных in vitro у детей с гематологическими и онкологическими заболеваниями

• Автор: Устюгов, Андрей Юрьевич
• Шифр специальности: 14.01.21
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 83 с. : 15 ил.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ:

ГСК - гемопоотические стволовые клетки КМ - костный мозг

СКПК- стволовые клетки периферической крови

КСФ- колонии стимулирующий фактор

КОС - колониеобразующая способность

МСК - мезенхимальная, стромальная клетка

ММСК- мультипотептные мезенхимальные стромальные клетки

c-kit-фактор роста стволовых клеток

CD - кластер дифференцировки

CFU-F - (КОЕф) - колониеобразующая единица фибробластов

МАРС - мультипотентные взрослые клетки предшественники

МНС-главный комплекс гистосовместимости
HLA-человеческий лейкоцитарный антиген
NK-натуральные киллеры
DC- дендритные клетки
IDO- индоламин-2,3-диоксигеназа
РОЕ2-простогландин Е2
T-reg-регуляторные Т клетки
TGF-b-трансформирующий ростовой фактор
HGF-гепатоцит ростовой фактор
INF-y - интерферон
TNF-a- фактора некроза опухоли
МДС- миелодиспластический синдром
OJ1JI- острый лимфобластный лейкоз
OMJ1- острый миелобластный лейкоз
РТПХ- реакция трансплантат против опухоли
Аденлейкод-я-Х - сцепленная адренолейкодистрофия
ТКИН - Тяжелая комбинированная иммунная недостаточность
ЮММЛ - ювенильный миеломоноци гарный лейкоз
ОБЛ - острый бифенотипический лейкоз
АА- апластическая анемия
ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Мезенхимальные клетки и стромальное микроокружение
1.2 Роль мезенхимальных клеток в гомопоэзс
1.3 Иммунофенотипическая идентификация МСК
1.4 Методы выделения МСК
1.5 Свойства МСК
1.6 Иммуномодулирующие свойства МСК
1.7 Применения МСК in vivo:
1.7.1 Применение МСК у животных
1.7.2 Применение МСК у людей
1.8 Безопасность применения
1.9 Иммуногенетика
1.10 Физиологическая роль МСК
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 Образцы КМ для культивирования МСК
2.2Дети, получавшие МСК для ко-трансплантаций
Дети, получавшие МСК для контроля РТПХ
2.3 Образцы КМ для оценки химеризма МСК
2.4 Клоногенное культивирование стромальных фибробластов костного мозга
2.5 Индукция дифференцировки мезенхимальных предшественников
2.6 Иммунофенотипирование методом проточной цитофлюорометрии
2.7 Изучение динамики роста МСК при длительном культивировании
2.8 Определение зависимости содержания стромальных клеток в культуре от
времени доставки образца костного мозга в лабораторию
2.9 Приготовление цитогенетических препаратов
2.10 Кариотипирование
2.11 Анализ частоты анеуплоидии

2.12 Клоногенное культивирование стромальных фибробластов костного мозга для изучения химеризма
2.13 Методика определения химеризма (метод тнпирования БТК-локусов)
2.14 Бактериологическое исследование МСК
2.15 Определение ДНК цитомегаловируса человека (СМУ)
2.16 Статистическая обработка данных
Глава 3. Результаты и их обсуждение
ЗЛМорфологнческое подтверждение используемой нами методики выделения и
культивирования МСК
3.2Дифференцнровочные потенции клеток получаемой нами культуры МСК
костного мозга
3.3Светооптические характеристики МСК при длительном культивировании
3.4 Влияние сроков культивирования на фенотипический состав монослойной
культуры
3.5Интенсивность экспрессии, характерных для МСК антигенов при культивировании
З.бДинамика роста клеточной популяции
3.7Определение зависимости содержания стромальных клеток в культуре от
времени доставки костного мозга в лабораторию
3.8Кариотипирование мононослойной культуры костного мозга
3.9Частота анеуплоидни МСК
3.10 Бактериологическое исследование МСК
3.11 Определение ДНК цитомегаловируса человека (СМУ)
3.12 Клиническое применение культивируемых МСК у детей
ЗЛЗИсследование химеризма МСК костного мозга у пациентов, перенесших
аллогенную трансплантацию КМ
3.14 Результаты линейного химеризма
Выводы
Практические рекомендации
Список литературы

после введения у большинства больных. Приживление быстрое. Побочных явлений не отмечено (110).
Нопуйг еГ а1, использовал МСК для восстановления кости пациента с остеогенным дефектом (114). Тем самым, предполагая, что дифференцировка МСК в индивидуальные тканевые линии, прежде всего, связана с ткане-специфичным микроокружением.
В одном из мультицентровых клинических исследований, культуры МСК выделенные из костного мозга от НЬА идентичных сиблингов были котрансплантированы с НЬА идентичными гемопоэтическими ГСК у 46 пациентов получивших Аллогенные трансплантации ГСК, после миелоблативного режима кондиционирования (111). МСК были введены за 4 часа до инфузии ГСК, однократно, без эктопических клеточных образований, без увеличения объема и тяжести РТПХ. В сравнении с историческим контролем, не отмечалось явного ускорения приживления трансплантата или предотвращение отторжения трансплантата.
В Европейском протоколе исследования 1-1Г фазы, 13 детям были трансплантированы гаплоидентнчиые стволовые клетки в комбинации с МСК, полученными из КМ донора (112). Не отмечалось немедленного враждебного эффекта после введения МСК, тем не менее доля несостоятельности трансплантата или отторжения в контрольной группе из 52 пациентов было 20%. Все пациенты были обследованы и по предварительным данным отмечалось восстановление лейкоцитов, несмотря на то, что кинетика приживления трансплантата была сходна. В дальнейшем для возможного улучшения клинического эффекта, были использованы МСК в некоторых клинических случаях. Результат в данных клинических случаях указывал па то, что МСК могут оказывать не только предупреждающий эффект на развитие РТПХ, но также оказывать хороший терапевтический эффект на РТПХ после аллогеной трансплантации ГСК (113). В настоящее время введение МСК, пациентам с острой и хронической РТПХ, используется как терапевтическая опция. Из 40 пациентов с тяжелым течением острой РТПХ, у 19 пациентов зарегистрирован полный ответ, у 9 пациентов показано улучшение состояния, у 7 пациентов ответа не получено, у 4-х пациентов отмечалось стойкое течение болезни, и у 1 пациента оценка состояния было