Молекулярная диагностика вирусов гепатита C,B,G и парвовируса B19 у гематологических больных

• Автор: Судариков, Андрей Борисович
• Шифр специальности: 14.01.21
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 199 с. : ил.

Оглавление

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Амплификационные методы определения вирусных нуклеиновых кислот

Количественное определение нуклеиновых кислот

Метод лимитирующих разведений

Конкурентная ПЦР

Real-time ПЦР

Внутренние стандарты

Свободные РНК и ДНК-стандарты
Биологические стандарты
Генноинженерные стандарты
Армированные РНК-стандарты
Ретровирусы
Структура генома и жизненный цикл ретровирусов группы MuLV
Принципы конструирования ретровирусных векторов
Упаковывающие клетки
Природа вируса гепатита С
Организация генома HCV
Вариабельность генома HCV и его генотипы
Клиническое значение генотипов HCV
Вакцина против HCV
Вирусная репликация
Репликационный цикл
Динамика репликации
Определение РНК HCV при остром и хроническом гепатите С
Мониторинг уровня РНК HCV в течение терапии
Природа вируса гепатита В
Организация генома и продукты вирусных генов
Жизненный цикл вируса
Мутационные изменения генома вируса
Ргесоге-мутация в С-гене
УМИИ-мутация в Р-гене
ПЦР-диагностка вирусного гепатита В
Изменение концентрации вируса в крови. Количественная ПЦР-диагностика
ПЦР-диагностика ргесоге- и УМИИ-мутаций
Вирус гепатита С
Биология вируса гепатита С
Роль вируса гепатита й в клинике
Парвовирус В
Биология РУ В
Роль вируса парвовируса В19 в генезе парциальной аплазии кроветворения
Геномная структура и организация РУ В
Диагностика парвовирусной инфекции
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Образцы сывороток. Создание банка препаратов
Выделение мононуклеарных клеток из крови и костного мозга
Выделение РНК из клеток крови и костного мозга
Выделение РНК из сыворотки
Гель-электрофорез амплифицированной ДНК
Определение концентрации плазмидной ДНК
Обратная транскрипция и «пе51еб»-ПЦР
ПЦР определение РНК вируса гепатита С по методике Окамото X. и Накамура Т
ПЦР определение РНК вируса гепатита С по разработанной нами методике
ПЦР определение ДНК вируса гепатита В непосредственно с сывороткой без
отдельной стадии выделения ДНК
Аллель-специфическая полимеразная цепная реакция
Выбор праймеров для ПЦР
Конструирование внутреннего стандарта. Клонирование внутреннего стандарта
Клонирование фрагмента РНКHCVгенотипа lb в вектор pGEM-TEasy
Переклонирование модифицированной кДНК HCVв ретровирусный вектор pBabe-Puro.

Получение пакующей клеточной линии
Трансфекция pBabe/HCV* в клетки пакующей линии PG
Определение титра ретровирусных частиц в культуральном супернатанте
Клонирование внутреннего стандарта для гепатита В
Использование внутреннего стандарта для качественного определения и
генотипирования РНК HCV
Использование внутреннего стандарта для количественного определения РНК HCV.

Использование внутреннего стандарта в экспериментах с разведенными
сыворотками
Количественное определение ДНК вируса гепатита В методом конкурентной ПЦР.

Полимеразная цепная реакция для определения ДНК парвовируса В
Клонирование внутренного стандарта для количественного определения ДНК PV

Построение калибровочной кривой
ПЦР в реальном времени для определения PV В
Полимеразная цепная реакция для определения РНК вируса гепатита G
Метод мультиплексного определения вирусов гепатита С, гепатита В и парвовируса В19 в сыворотке крови больных и доноров
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
ПЦР-определение HCV
Разработка диагностикума для одновременного скринирования и генотипирования
вируса гепатита С
Конструирование внутреннего стандарта. Получение пакующей линии клеток
Получение пакующей линии клеток
Определение титра ретровирусных частиц
Использование внутреннего стандарта при качественном определении и генотипировании РНК HCV

отмечено, что при инфицировании генотипом lb наблюдается более тяжелое течение заболевания, развитие цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы [64], [65], [66], [67]. Пациенты с генотипом За имеют более высокий уровень ALT, чем пациенты с генотипом 1. При этом уровень фиброза печени более выражен у пациентов с генотипом 1Ь [68]. У пациентов с моноклональной гаммапатией, смешанной криоглобулинемией преобладает генотип 2 [69]. Генотип 1Ь является высоким фактором риска развития цирроза после трансплантации печени [70], [71]. Инфицирование пациента вирусом гепатита С с генотипом 1Ь ведет к более быстрому прогрессированию HIV инфекции [72]. Следует отметить, что, по мнению других авторов, различные HCV генотипы не отличаются в клиническом отношении, и не наблюдается ясной связи с исходом и тяжестью заболевания [45], [73].
Инфицирование любым генотипом может привести к циррозу печени и гепатоцеллюлярной карциноме. И частота этих осложнений одинакова для разных генотипов [46]. Однако, что касается связи генотипа HCV с эффективностью противовирусной терапии, то в этом вопросе мнение подавляющего большинства исследователей сходится - ответ на терапию различен для разных генотипов, степень ответа у пациентов с генотипами 2 и 3 в 2-3 раза выше, чем у пациентов с генотипом 1 [74]. При монотерапии • интерфероном , устойчивый ответ наблюдается у 18%
Ч * * К ' 1 «Ц ч ** *
пациентов инфицированных субтипом 1Ь и у 55% пациентов инфицированных другими генотипами [75]. При комбинированной схеме лечения (интерферон плюс рибавирин) стойкий ответ наблюдался у 28% пациентов, инфицированных субтипом lb, и у 66% пациентов, инфицированных другими генотипами [57]. Повышенная чувствительность инфекции генотипов 2 и 3 показана при изучении вирусной кинетики в течение интерфероновой терапии: уменьшение количества РНК HCV в среднем сильнее выражено для пациентов с генотипом 2 или 3, чем lb [76], [58], [77]. Такая повышенная чувствительность важна в клиническом отношении - оптимальный срок лечения интерфероном для генотипов 2 и 3 составляет 24 недели, для генотипа 1 - 48 недель [74], [57], [54], [53], [50], [51]. Устойчивый вирусологический ответ у пациентов генотипов 2 и 3 достигается при более низких дозах рибавирина (800мг вместо 1000 и 1200 мг ежедневно) и пегинтерферона (для альфа-2Ь еженедельная доза 0,5 мкг/кг была также эффективна, как и более высокая доза 1,5 мкг/кг)[53]. Молекулярная основа повышенной чувствительности пациентов с генотипами 2 и 3 не