ДНК-ДНК взаимодействия в области микросателлитных повторов как фактор генетической нестабильности, вовлеченный в процесс канцерогенеза

• Автор: Карпеченко, Наталья Юрьевна
• Шифр специальности: 14.01.12
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 112 с. : 19 ил.

Содержание
ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Гомологичная рекомбинация

1.1.1. Основные стадии и пути гомологичной рекомбинации

1.1.2. Основные белки, вовлеченные в соматическую гомологичную рекомбинацию у человека

1.1.3. Гомологичная рекомбинация в процессе канцерогенеза

1.1.4. Гомологичная рекомбинация при лечении онкологических заболеваний

1.1.5. Распределение рекомбинационных событий по геному

1.2. (СА/ТС)п-микросателлитные последовательности

1.2.1. Локализация и особенности строения ро1у(СА/ГС)-локусов
1.2.2. Функциональные возможности (САЛЧЗ)п-повторов
1.2.2.1. Роль микросателлитных повторов в организации хроматина
1.2.2.2. Роль (САЛГО)п-повторов в регуляции экспрессии генов
1.2.2.3. Участие (СА/ТО)п-повторов в гомологичной рекомбинации
1.2.3. Структурные особенности ро1у(СА/ТО)
1.2.3.1.ро1у(СА/ТО и г-форма ДНК
1.2.3.2. ро1у(СА/ГС) и квадруплексная структура
1.2.4. Мутационная изменчивость ро1у(САЛХт) и системы контроля стабильности у различных организмов
1.2.4.1. Механизмы изменения числа повторяющихся единиц в СА-микросателлитах
1.2.4.2. Факторы, влияющие на стабильность (СА/ТО)п-повторов
1.3. СА-микросателлиты как сайты инициации и терминации
гомологичной рекомбинации
1.3.1. СА-микросателлиты как сайты терминации гомологичной рекомбинации: модельные системы и предварительные данные

1.3.2. СА-микросателлиты как сайты инициации гомологичной
рекомбинации
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Список использованных реактивов и олигонуклеотидов
2.2. Процедура клонирования последовательностей (CA/TG)io, (CA/TG) 15, (CA/TG)25, (CA/TG)3i и RI (рэндомная) в полилинкерный сайт плазмиды PUC19
2.2.1. Фосфорилирование синтетических олигонуклеотидов
2.2.2. Процедура формирования дуплексов
2.2.3. Реакция лигирования ДНК
2.2.4. Трансформация бактериальных клеток E.Coli штамма XLIO-Gold
2.2.4.1. Приготовление компетентных клеток E. Coli штамма XL1 О-Gold
2.2.4.2. Трансформация компетентных клеток E.Coli штамма XLIO-Gold с использованием «бело-голубой» селекции
2.3. Выделение плазмидной ДНК
2.4. Выделение геномной ДНК из ткани
2.5. Обработка плазмидной ДНК эндонуклеазами рестрикции
2.6. Амплификация ДНК с помощью полимеразной цепной реакции
2.7. Осаждение ДНК в этаноле
2.8. Кинирование 5'-концов олигонуклеотидов радиоактивным фосфором
2.9. Электрофоретическое разделение ДНК
2.10. Визуализация ДНК
2.10.1. Окрашивание ДНК с помощью SYBR Gold
2.10.2. Окрашивание ДНК с помощью бромистого этидия
2.10.3. Авторадиография
2.10.4. Визуализация ДНК, несущей флуоресцентные зонды FAM и TAMRA
2.11. Извлечение ДНК из агарозного геля
2.11.1. Экстракция с помощью ДНК-связывающего матрикса на основе двуокиси кремния

2.11.2. Выделение ДНК с помощью электроэлюции
2.12. Определение концентрации ДНК и SYBR Gold
2.13. Электронная микроскопия
2.14. Статистическая обработка результатов электронной микроскопии
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1. Оптимизация метода визуализации ДНК с помощью флуоресцентного расителя SYBR Gold по протоколу предокрашивания
3.1.1. Определение стабильности комплекса SG - ДНК при проведении агарозного гель-электрофореза
3.1.2. Выявление несвязавшегося с ДНК SYBR Gold в растворах при различных количественных соотношениях краситель/ДНК
3.1.3. Зависимость электрофоретической подвижности окрашенной ДНК от
соотношения SG/ДНК
3.2. Изучение структурно-функциональных особенностей (CA/TG)n-повторов, важных для процессов инициации и терминации гомологичной рекомбинации
3.2.1. Анализ влияния poly(CA/TG) на процесс миграции точки перекреста структур Холлидея
3.2.1.1. Модельная система
3.2.1.2. Анализ локализации точки перекреста в популяциях структур Холлидея, образованных ПЦР-продуктами
3.2.1.3. Анализ локализации точки перекреста в популяциях структур Холлидея, образованных фрагментами плазмидной ДНК
3.2.1.4. Анализ локализации точки перекреста в популяциях структур Холлидея, образованных фрагментами плазмидной ДНК, несущими разное
число (CA/TG)n-noBTopoB
3.2.2.0собенности олигонуклеотидной инвазии во внутреннюю
комплементарную последовательность дуплексной ДНК
3.2.2.1. Оптимизация метода визуализации ДНК-ДНК взаимодействий с помощью флуоресцентно меченных олигонуклеотидов

Квадруплексы были обнаружены в тромбинсвязывающих аптамерах, сайтах переключения классов иммуноглобулинов, регуляторных участков гена инсулина и промоторах некоторых онкогенов (с-МУС, ВСЬ2) [121]. Кроме того, известно, что С-богатые последовательности находятся в теломерных областях, где формируют стабильный в физиологических условиях квадруплекс, нечувствительный к действию эндо- и экзонуклеаз [122].
Стабилизация квадруплексной структуры в случае (ОТ)п-последовательности, однако, сильно зависела от условий. На ее формирование влияли не только ионные параметры (0,1 М КС1) и температура (1-3 °С), но и количества повторяющихся единиц. Более высокие и узкие пики в спектрах КД были показаны для й(ОТ)8 и с!(ОТ)1б [123].
На основании полученных данных для (ОТ)п-последовательности предложена модель внутримолекулярного параллельного квадруплекса с квартетами гуанинов, стабилизированными стэкинг-контактами и петлями, состоящими из единичных тиминов. Однако для подтверждения образования именно этой структуры требуются дополнительные исследования, и кроме того, необходим поиск условий стабилизирующих вТ-квадруплекс при физиологической температуре.
1.2.4. Мутационная изменчивость ро1у(СА/ТС) и системы контроля стабильности у различных организмов
Одним из общих свойств микросателлитных повторов является повышенная частота мутаций по сравнению с неповторяющейся последовательностью нуклеотидов (10"6-10'2 против 10’9-10'8, соответственно) [124]. Причем скорость мутирования микросателлитных повторов различается не только в зависимости от типа повторяющейся единицы (моно-, динуклеотидные и т.д.), нуклеотидного состава, типа повтора (простой, сложный, несовершенный), его локализации и микроокружения, но и принадлежности организма к той или иной таксономической группе.