Координированное изменение экспрессии кавеолина-1 и других рафт-образующих белков в опухолевых клетках человека

• Автор: Архипова, Ксения Анатольевна
• Шифр специальности: 14.01.12
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 134 с. : ил.

Содержание'
Введение

Список использованных сокращений

Г лава 1. Обзор литературы. Рафт-образугощие белки

1.1. Введение

1. 2. Семейство белков кавеолинов

1.2.1. Строение кавеолинов

1.2.2. Строение кавеол

1.2.3. Кавеолин-1 и нормальная физиология клетки

1.2.4. Кавеолин-1 и его роль в канцерогенезе

1.3. Семейство БРРН домен-содержащих белков

1.3.1. Строение и локализация флотиллинов
1.3.2. Роль флотиллинов в везикулярном транспорте
1.3.3. Роль флотиллинов в активации Т-лимфоцитов
1.3.4. Флотиллины и регуляция поглощения глюкозы
1.3.5. Роль флотиллинов в перестройке цитоскелета и формировании межклеточных контактов
1.3.6. Роль флотиллинов в канцерогенезе
1.3.7. Семейство стоматинов
1.3.8. Другие представители семейства БРГН белков
1.4. Тетраспонины
1.5. Галектины
Глава 2. Материалы и методы
2.1. Характеристика исследованных опухолевых образцов
2.2. Клеточные линии
2.3. Лентивирусные конструкты
2.4. Выделение нуклеиновых кислот
2.4.1. Выделение плазмидной ДНК

2.4.2. Выделение РЕК из образцов тканей легкого и опухолей мезенхимального происхождения
2.5. Аналитический электрофорез ДНК в агарозных гелях
2.6. Полимеразная цепная реакция, сопряженная с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР)
2.7. Полимеразная цепная реакция в реальном времени
2.8. Трансфекция и получение лентивирусных частиц
2.9. Инфицирование клеток
2.10. Анализ белков
2.10.1. Приготовление белковых лизатов из образцов опухолевых и условно нормальных тканей
2.10.2. Приготовление клеточных лизатов
2.10.3. Вестерн-блот анализ
2.11. Метод зимографии
2.11.1. Приготовление образцов для определения ферментативной активности протеаз
2.11.2. Анализ желатиназной активности
2.11.3. Анализ активности иРА
2.12. Статистическая обработка результатов
2.13. Растворы, реагенты и среды
Глава 3. Результаты
3.1. Определение экспрессии рафт-образующих белков в НМРЛ
3.1.1. Определение уровня относительной экспрессии мРНК генов CAV-1, FLOT-1 и STOM методом ПЦР в реальном времени
3.1.2. Корреляционный анализ изменений относительной экспрессии мРНК генов CAV-1, FLOT-1 и STOM
3.1.3. Определение уровня экспрессии тепа. FLOT-2 методом ОТ-ПЦР
3.1.4. Определение экспрессии белка кавеолина-1а методом Вестерн-блот анализа
3.2. Определение рафт-образующих белков в мезенхимальных опухолях..

3.3..Сравнение групп HMPJI и мезенхимальных опухолей по экспрессии РОБ
3.4. Совместный анализ экспрессии кавеолина-1 и малой ГТФазы RalA в группе HMPJT
3.5. Определение активности протеаз и экспрессии uPAR в опухолях мезенхимального происхождения
3.5.1. Определение активности металлопротеаз
3.5.2. Определение активности урокиназо-подобного активатора плазминогена
3.6. Анализ экспрессии РОБ и белков семейства Rai на модели клеточной линии Н322 при направленном подавлении экспрессии кавеолина-1
Глава 4. Обсуждение
Выводы:
Список литературы
Приложение

1.3.2. Роль флотиллинов в везикулярном транспорте.
Флотиллины, как и кавеолины, олигомеризуясь, могут формировать впячивания в плазматической мембране и участвовать в процессе эндоцитоза [123-125]. В настоящее время об участии флотиллинов в везикулярном транспорте известно достаточно мало. Судя по всему, флотиллины осуществляют динамин-независимый эндоцитоз GPI-заякоренных белков, а также ряда других белков [126]. Данный процесс регулируется Fyn-киназой, которая, локализуясь во флотиллиновых рафтах, фосфорилирует как флотиллин-1, так и флотиллин-2 [127, 128].
Также получены данные об участии флотиллина-1 в созревании фагосом, однако механизм его воздействия на этот процесс пока неизвестен [129].
1.3.3. Роль флотиллинов в активации Т-лимфоцитов.
Активация Т-лимфоцитов после контакта с антигенпрезентирующими клетками сопровождается сборкой на плазматической мембране сигнальных комплексов, содержащих Т-клеточные рецепторы (TCR, T-cell antigen receptor), к которым привлекаются ко-стимулирующие молекулы, белки адгезии и многие другие белки, участвующие в передаче активирующего сигнала. Было показано, что флотиллины, экспрессирующиеся лимфоцитами, формируют на их плазматической мембране флотиллиновые микродомены, которые накапливаются на одном полюсе клетки еще до ее активации. В то же время, до поступления стимула извне сигнальные молекулы не имеют определенной локализации в плазматической мембране. Активация Т-лимфоцитов приводит к накоплению компонентов TCR сигнального комплекса именно в заранее сформированных участках плазматической мембраны, содержащих флотиллины. К таким компонентам комплекса относятся, например, Thy-1 и РгР (последний запускает активацию МАР киназного каскада и привлекает CD3 — главный компонент TCR комплекса). Таким образом, флотиллин-содержащие микродомены могут служить