Индукция опухолевых клонов у личинок дрозофилы канцерогенами млекопитающих

• Автор: Кирсанов, Кирилл Игоревич
• Шифр специальности: 14.01.12
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 125 с. : ил.

Оглавление

Список сокращений

1. Введение

2. Литературный обзор

2.1. Тестирование химических канцерогенов на дрозофиле

2.1.1. Мутагенез в герминальных клетках и соматических клетках как основа создания краткосрочных тестов мутагенных соединений на дрозофиле
2.1.2. Основные типы нарушений ДНК и возможности их выявления при краткосрочном тестировании на дрозофиле
2.1.3. Роль соматической рекомбинации в канцерогенезе и частота этого события при индукции мозаичного клона у дрозофилы

2.2. Метаболическая активация проканцерогенов в модельных системах

2.2.1. Система активации проканцерогенов у дрозофилы

2.2.2. Влияние генотипических особенностей дрозофилы на чувствительность SMART к проканцерогенам
2.3.Возможности моделирования канцерогенеза на дрозофиле
2.3.1. Консервативность генов-супрессоров опухолевого роста в эволюции как
основа экстраполяции результатов тестирования на высокоорганизованные системы
2.3.2. Тест на бластомогенную активность с использованием гетерозигот wts/+.
2.3.3. Основные направления оптимизации теста на бластомогенную активность химических соединений на дрозофиле
2.3.4. Ген контроля пролиферации и циркадных ритмов dco
2.3.5. Высококонсервативный ген-супрессор опухолевого роста Dmp
2.3.5.1. Структура белков р53 и Dmp
2.3.5.2. Регуляция активности р53 и Dmp
2.3.5.3. Функции р53 и Dmp
3. Материалы и методы
3.1. Список используемых реактивов
3.2. Бактериальный тест на мутагенную активность
3.3. Методы работы с D.melanogaster
3.3.1. Перечень используемых линий дрозофил
3.3.2. Описание мутаций, использованных в работе
3.4. Постановка теста на соматический мутагенез и рекомбинацию на дрозофиле (SMART)
3.5. Создание трансгенной линии
3.5.1.Клонирование кДНК мутантного р53 в плазмиду pUAST
3.5.1.1.Амплификация гена р53 с помощью полимеразной цепной реакции
3.5.1.2.Секвенировани с
3.5.1.3.Обработка ДНК с помощью эндонуклеаз рестрикции
3.5.1.4.Реакция лигирования
3.5.1.5.Трансформация компетентных клеток, выделение и анализ плазмиды
с клонированной кДНК р
3.5.2. Проверка экспрессии трансгена
4. Результаты собственных исследований
4.1. Действие химических канцерогенов на гетерозигот wtsP4/+
4.2. Влияние накопления мутаций по нескольким генам-супрессорам опухолевого роста на частоту формирования опухолей
4.3. Влияние ингибирования Dmp53 методом РНК-интерференции на частоту формирования опухолевых клонов
4.4. Создание трансгенной линии дрозофилы, несущей р53 человека, и проверка уровня экспрессии трансгена
4.5. Влияние экспрессии мутантного р53 человека в клетках дрозофилы на частоту появления опухолевых клонов wts
4.6. Визуализация клонов wts на стадии личинки
5. Обсуждение результатов
5.1. Исследование чувствительности тест-системы к химическим канцерогенам разных классов
5.2. Увеличение чувствительности и разрешающей способности теста
5.2.1. Подбор более «сильного» аллеля wts
5.2.2. Влияние накопления мутаций по нескольким генам-супрессорам на частоту образования кномов
5.2.3. Влияние ингибирования гена-супрессора Dmp53 с помощью РНК-интерференции
5.3. Исследование влияния экспрессии мутантного р53 человека на формирование опухолевых клонов у дрозофилы
5.4. Оптимизация системы регистрации результатов SMART на гегерозиготах wts/+
6. Выводы
7. Список литературы

Список сокращений
і Somatic Mutation And Recombination Test (тест
SMART .. гг
на соматический мутагенез и рекомбинацию)
2-АФ 2-аминофлуорен
БП Бенз(а)пирен
1234-ДБА ! 1,2,3,4-дибензантрацен
1256-ДБА 1,2,5,6--дибензантрацен
ДМСО Диметилсульфоксид
2,7-диамино-4,9-диокси-5,10-диоксо-4,5,9,10-тетрагидро-4,9-диазапирен
ДМБА ’ Диметилбензантрацен
ДЭАБ Диэтиламинобензофенон
20-МХ 20-метилхолантрен
3-МеДАБ 3 ’-метил-4-диметиламиноазобензол
... „г 4-( метилнитрозамино)-1-(3-пиридил)
ГІНК _
: бутанон
МННГ ] И-метил-И-нитро-К-нитрозогуанидин
НАДФ Никотинамидадениндинуклеотидфосфат
SDS Натрия додецилсульфат
1-НП 1-нитропирен
2-НФ I 2-нитрофлуорен
ОААТ Орто-аминоазотолуол
PBS Фосфорно-солевой буфер
EDTA Этилендиаминтетрауксусная кислота,
динатриевая соль
являются: сочетание в одной линии нескольких видимых мутаций в одной хромосоме (в цис- или трансположениях) [Vogel et al, 1999; Graf et al., 1984], либо в разных хромосомах [Smijs et al, 2004] и ингибирование генов-супрессоров с целью увеличения частоты соматической рекомбинации [Сидоров P.A. и соавт, 2004].
В связи с вышеизложенным, следующий раздел посвящен генам-супрессорам опухолевого роста dco, нарушение функций которых приводит к формированию соматических опухолевых клонов как спонтанно, так и при индукции химическими канцерогенами, а так же Dmp53, консервативному гомологу р53 человека. Как было показано, экспрессия мутантного продукта этого гена стимулирует формирование клонов wts.
2.3.4. Ген контроля пролиферации и циркадных ритмов dco.
Dco - ген, расположенный в третьей хромосоме, в цитогенетическом
районе 100А5,6 -100В1,2, является необходимым для нормального развития и
контроля роста имагинальных дисков личинки D.melanogaster. Мутация dco3 в
гомозиготном состоянии является летальной. При этом клетки имагинального
диска продолжают делиться дольше, чем при нормальном развитии личинки. В
результате развиваются неспособные вступить в метаморфоз гигантские
личинки с крупными имагинальными дисками, [Zilian О. et al., 1999]. Было
показано, что при имплантации имагинального диска, клетки которого
содержат мутацию dco3, в личинку дикой линии на ранних стадиях развития,
имплантированный диск продолжает расти после того, как развитие
нормальных дисков уже прекращается, что указывает на то, что чрезмерный
рост диска является автономным эффектом мутации. В течение всего роста
диск сохраняет свою однослойную эпителиальную структуру и
дифференцируется в соответствующую диску структуру, но со значительными
морфологическими и функциональными изменениями. При определённых
условиях лишь небольшой процент особей выживает и достигает стадии,
непосредственно предшествующей вылуплению из куколки. При этом
характерными отклонениями данных мух являются: гипертрофированные лапы
со множеством щетинок, полное или частичное отсутствие глаз,