Эпигенетические изменения в опухолях шейки матки: гипер- и гипометилирование повторяющихся элементов ДНК

• Автор: Катаргин, Алексей Николаевич
• Шифр специальности: 14.01.12
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 116 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1.Введени е

1.2. Ретротранспозоны

1.2.1.Не содержащие ЬТЯ ретротранспозоны

1.2.2. ЬТЯ-содержащие ретротранспозоны

1.3. Сателлнтные повторы

1.4. Макросателлитные 3,3-кЬ повторы

1.5. Заключение
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Клинические материалы
2.2. Клеточные линии
2.3. Выделение ДНК и РНК
2.3.1. Одновременное выделение ДНК и РНК из образцов тканей и из клеточных культур гуанидинизотиоцианатным методом
2.4.2 Выделение плазмидной ДНК из бактерий
2.4.3 Определение концентрации и качества ДНК и РНК
2.5. Блот-гибриднзация по Саузерну
2.5.1 Обработка геномной ДНК эндонуклеазами рестрикции
2.5.2 Электрофоретическое разделение фрагментов геномной ДНК в агарозном геле
2.5.3. Перенос фрагментов ДНК на нейлоновую мембрану
2.5.4. Получение радиоактивно-меченых зондов
2.5.5. Гибридизация и отмывка блотов
2.5.6 Гибридизация продуктов ПЦР
2.5.7 Анализ авторадиографического изображения
2.6. Реакция обратной транскрипция РНК
2.7. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
2.7.1.Праймеры и зонды
2.7.2 Электрофорез продуктов ПЦР в агарозном геле
2.7.3 Выделение продуктов ПЦР из агарозного геля с помощью мембраны ЭЕАЕ
2.8. Клонирование продуктов ПЦР
2.9. Бнсульфитная конверсия ДНК
2.10. Сиквенированне ДНК после бисульфитной конверсии

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Анализ статуса метилирования 3,3-кЬ повторов в нормальных тканях
3.2. Анализ статуса метилирования 3,3-kb повторов в клеточных линиях карцином шейки матки
3.3. Частота изменения статуса метилирования 3,3-kb повторов в опухолях шейки матки
3.4. Подтверждение гиперметилирования 3,3-kb повторов в нормальных тканях и карциномах шейки матки методом бисульфитного сиквенирования ДНК
3.5. Гиперметилирование 3,3-kb повторов и гипометилирование повторов Sat2 в клеточных линиях и опухолях шейки матки
3.6. Профиль метилирования генов и повторов в опухолях шейки матки
3.7. Исследование уровня экспрессия генов DUX в нормальных тканях, клеточных линиях и опухолях шейки матки методом ОТ-ПЦР
3.8. Сравнение статуса метилирования и транскрипции 3,3-kb повторов в клеточных линиях и опухолях шейки матки
3.9. Восстановление транскрипции генов DUX при обработке клеток карцином шейки матки 5-аза-дезоксицнтидином
3.10. Анализ статуса метилирования S/MAR в клеточных линиях карцином шейки матки с гипо- и гиперметилированием 3,3-kb повторов
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Список сокращений
ГГЦ - гуанидинизотиоцианат ДМСО - диметилсульфоксид
ДНК Л-Hind III - ДНК фага лямбда, обработанная эндонуклеазой Hind III; маркер молекулярной массы ДНК кДНК - ДНК, синтезированная с РНК-матрицы в реакции обратной транскрипции ПЦР - полимеразная цепная реакция
ОТ-ПЦР - обратная транскрипция РНК с последующей ПЦР
т.п.н. - тысяча пар нуклеотидов
п.н. - пары нуклеотидов
ШМ - шейка матки
РШМ - рак шейки матки
ЭДТА - этилендиаминтетрацетат натрия
SDS - додецилсульфат натрия
IPTG - изопропилтио-р-О-галактозид
X-gal - 5-бром-4-хлор-3-индол-Р-галакгозид
dNTP - смесь четырех дезоксирибонуклеотидтрифосфатов в равных пропорциях.
5тС - 5-метилцитозин 5-аза-дС - 5-аза-2'-дезоксицитидин H2Od-дистиллированная вода Нг02<) - бидистиллированная вода
HPV - вирус папилломы человека (от англ. Human Papillomavirus)

белков семейства Pax и Otx, также имеющим в своем составе парные гомеодомены [Соррее et al., 2004]. DUX4 оказался также высоко гомологичным транскрипту DUX1, клонированному ранее из клеткок рабдомиосаркомы (Ding et al., 1998). Кроме DUX4 в настоящее время известно еще 4 транскрипта семейства DUX, обнаруженных в скелетных и сердечных мышцах, некоторых эмбриональных тканях и клеточных линиях рабдомиосаркомы и гепатокарциномы (Beckers et al., 2001). Все они имеют высокую степень гомологии в области парных гомеобоксов, но различаются по длине (рис 1.1). Самым длинным из них является DUX4, его транскрипты обнаружены в миобластах больных FSHD (Dixit et al., 2007; Kowaljow et al., 2007). Кроме того, поблизости от локуса D4Z4 есть отдельная транкированная и инвертированная по отношению к локусу копия 3,3-kb-повтора - DUX4c, содержащая ОРС. Последняя отличается от ОРС DUX4 только заменой 82 аминокислот на С-конце на 32 неродственные аминокислоты (Wright et al., 1993).
АТС STOP
I I Kpnl
DVX1 cDNA
t1 I
DUX2 -focj-f TATAA P
r ,r*Jl
DVX3 foci—Ітлтллі' CZl-ПЗ
DVXS

DUX4 —Tgc~|—ІТАСЛЛ |1
Рис. 1.1. Структура генов семейства DUX. Изломанная стрелка -старт транскрипции, вертикальные стрелки - начало (кодон ATG) и конец рамки считывания, закрашенные прямоугольники гомеобоксы. По М.-С Beckers et al. 2001, с модификациями.