Участие малой ГТфазы ARF6 в канцерогенезе

• Автор: Книжник, Анна Вадимовна
• Шифр специальности: 14.01.12
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 130 с. : ил.

Список использованных сокращений
Введение
1. Обзор литературы. Малая ГТФаза Arf6
1.1 Структура белков Arf
1.2 Регуляция активности Arf6
1.3 Функции Arf6 в клетках
1.3.1 Arf6 и подвижность
1.3.2 Arfö и цитокинез
1.3.3 Arfö в метаболизме фосфолипидов
1.3.4 Arfö и эндоцитоз
1.3.5 Arfö и канцерогенез
2. Материалы и Методы
2.1 Клеточные линии
2.2 Образцы тканей
2.3 Выделение нуклеиновых кислот
2.3.1 Выделение плазмидной ДНК
2.3.2 Выделение РНК из образцов тканей легкого
2.3.3 Выделение фрагментов ДНК для клонирования из агарозных гелей
2.4 Аналитический электрофорез ДНК в агарозных гелях
2.5 Молекулярное клонирование
2.5.1 Получение компетентных клеток E
2.5.2 Трансформация компетентных клеток E.coli
2.5.3 Обработка ДНК рестрицирующими эндонуклеазами
2.5.4 Реакция лигирования
2.6 Обратная транскрипция РНК
2.7 Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
2.8 Трансфекция и получение ретровирусных частиц
2.9 Инфицирование клеток
2.10 Анализ белков
2.10.1 Приготовление клеточных лизатов
2.10.2 Приготовление лизатов из образцов тканей легкого
2.10.3 Вестерн-блот гибридизация
2.10.4 Анализ активности PLD
2.10.5 Приготовление образцов для определения ферментативной активности протеаз
2.10.6 Анализ желатиназной активности
2.10.7 Анализ активности иРА
2.11 Исследование клеточных характеристик в культурах in vitro
2.11.1 Анализ динамики роста клеток
2.11.2 Анализ клеточной подвижности методом «зарастания раны» in vitro (wound healing assay)
2.11.3 Тест на образование колоний в условиях разреженной популяции
2.11.4 Тест на образование колоний в полужидкой среде
2.11.5 Тест на движение по градиенту концентраций факторов роста
2.11.6 Тест на инвазию in vitro
2.12 Определение спонтанной метастатической активности
2.13 Статистическая обработка результатов
2.14 Растворы, реагенты и среды
3. Результаты
3.1 Получение ретровирусных векторов и клеточных линий, экспрессирующих различные варианты белка Arfö
3.2 Исследование характеристик полученных клеточных линий в культуре in vitro
3.2.1 Исследование динамики роста полученных культур
3.2.2 Анализ способности к колониеобразованию в условиях разреженной
популяции (клоногенность)
3.2.3 Анализ способности к неприкрепленному росту
3.2.4 Исследование миграционной способности полученных клеточных линий (“wound healing assay”)
3.2.5 Анализ движения по градиенту концентрации ростовых факторов
3.2.6 Анализ инвазивных свойств полученных клеточных линий
3.3 Анализ активности секретируемых протеаз, ремоделирующих ВКМ
3.3.1 Анализ уровня секреции матриксных металлопротеаз (ММР)
3.3.2 Анализ уровня секреции урокиназа-подобного активатора плазминогена (иРА)
3.4 Идентификация сигнального пути Arf6-PLD-mTOR-S6Kl
3.4.1 Экспрессия активного Arf6 приводит к стимуляции активности PLD
3.4.2 Аг 16-зависимая стимуляция PLD активирует mTOR-S6K сигнальный путь
3.5 Исследование влияния Arf6 на фосфорилирование основных митоген-активируемых киназ
3.6 Исследование спонтанной метастатической активности (СМА) полученных
клеточных линий
3.7 Получение Arl'6-производных клеточных линий НЕТ-SR RalAV23 и HET-SR RalBV23
3.8 Исследование спонтанной метастатической активности (СМА) полученных
клеточных линий
3.9 Анализ экспрессии Arf6 и RalA в образцах HMPJI
Обсуждение
Выводы
Список использованной литературы

Список использованных сокращений
АДФ аденозиндифосфат
АК аденокарцинома
вкм внеклеточный матрикс
ГДФ гуанозиндифосфат
ГТФ гуанозинтрифосфат
5’НТО 5’ нетранслируемая область
НМРЛ немелкоклеточный рак легкого
ПКРЛ плоскоклеточный рак легкого
РМЖ рак молочной железы
СМА спонтанная метастатическая активность
цомт центр организации микротрубочек
ЭПР эндо-плазматический ретикулюм
API адапторный белок 1 (от англ. adaptor protein 1)
Arf фактор рибозилирования АДФ (от англ. ADP ribosylation
factor)
Arp2/3 комплекс связанных с актином белков 2/3 (от англ. actin-
related protein complex 2/3)
Cdc42 гомолог белка контролирующего деление клеток 42 (от англ.
cell division control protein 42 homolog)
DAG диацилглицерол (от англ. diacylglicerol)
4E-BP белок связывающий эукариотический фактор инициации 4Е
(от англ. eukaryotic initiation factor 4E-binding protein)
ЕЕ ранняя эндосома (от англ. early endosome)
EEA1 антиген ранней эндосомы 1 (от англ. early endosome antigen 1)
EGF эпидермальный фактор роста (от англ. epidermal growth factor)
EGFR рецептор эпидермального фактора роста (от англ. epidermal
growth factor receptor)
ERC околоядерный эндоцитозный рециклизующий компартмент
(от англ. juxtanuclear endocytic recycling compartment)
пиноцитоза в клетках HeLa (Radhakrishna et al., 1996). Активация H-Ras также, как и Arfö-ГТФ, вызывает изменение в структуре мембраны и пиноцитоз. При такой стимуляции первичные пиносомы содержат Р1Р2 и РГРЗ (фосфатидил инозитол 3,4,5 трифосфат). Затем наблюдается потеря пиносомами PIP2 (для этого необходима инактивация Arf6), после чего происходит связывание с Rab5 и потеря PIP3. После этого происходит рециклизация тем же путем, что и при конститутивном эндоцитозе. При H-Ras стимулированном пиноцитозе происходит рекрутирование Akt к макропиносомам, тогда как при Arf6-стимулированном пиноцитозе происходит активация Arfl за счет рекрутирования ARNO (рис. 8) (Porat-Shliom et ah, 2008).
Недавно предложена новая модель участия Arf6 в регуляции эндоцитоза. Показано, что Arf6 с помощью N-концевой амфифильной спирали, ГТФ-зависимо встраиваемой в липидный бислой, создает и, в свою очередь, реагирует на степень искривления мембраны (membrane curvature). Ассоциация с мембранами Arf6-ГДФ и Arf'6-ГТФ происходит с разной эффективностью. Нестойкое связывание Arf'6-ГДФ с мембранами можно преодолеть высокой степенью искривления мембраны, например, при отпочковывании пузырька. Белки GEF стимулируют связывание Arf6 с ГТФ и включение спирали в мембрану, что приводит к стимуляции искривления мембраны. После встраивания спирали в мембрану создается диффузионный барьер, т.к. Arf6 не может передвинуться в место с негативным искривлением из места с позитивным искривлением, окружающим отпочковывающийся пузырек. Таким образом, достигается высокая локальная концентрация Агйб-ГТФ с низким уровнем диссоциации от мембраны, что приводит к привлечению эффекторов и белков оболочки к месту отпочковывания пузырька и дальнейшей стабилизации отпочковывающегося пузырька (рис. 9) (Lundmark et al., 2008).