Участие многофункционального белка YB-1 в регуляции Р-гликопротеина и в ответе клетки на стресс

• Автор: Вайман, Андрей Владимирович
• Шифр специальности: 14.00.14
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 99 с. : ил.

I. Обзор литературы

1.1. Мулыпифункционалъный белок УВ

1.1.1. Структура УВ

1.1.2. Функции УВ

1.1.3. УВ-1 и пролиферация клеток

1.1.4. Активация УВ-1 при стрессе

1.2. Множественная лекарственная устойчивость опухолевых клеток

1.2.1. Лекарственная устойчивость, обусловленная снижением накопления препарата внутри клетки

12.1.1. Множественная лекарственная устойчивость, обусловленная

Р-гликопротеином

12.1.2. Множественная лекарственная устойчивость, определяемая

белками семейства МЯР
12.1.3. Множественная лекарственная устойчивость и белок ВСЯР
12.1.4. Множественная лекарственная устойчивость, определяемая
белком ЬЯР
1.3. Роль белка УВ-1 в регуляции множественной лекарственной
устойчивости опухолевых клеток
1.3.1. Экспрессия и внутриклеточная локализация УВ-1 в культурах
опухолевых клеток, резистентных к химиопрепаратам
13.2. Исследование участия УВ-1 в регуляции генов и белков МЛУ
1.3.3. Исследование взаимосвязи между уровнем экспрессии
и внутриклеточной локализацией белка УВ-1 с экспрессией белка Р%р
и прогнозом лечения больных
II. Материалы и методы
11.1. Линии клеток, использованные в работе
11.2. Препапаты, использованные в работе
11.3. Выделение РНК и ОТ-ПЦР
11.4. Иммуноцитохимическое определение экспрессии YB-1 и белков МЛУ
11.5. Иммуноцитохимическое определение внутриклеточной локализации
YB-1 и окраска клеток на белки МЛУ
11.6. Иммунологический анализ клеточных лизатов (Western-blot анализ)
11.7. Трансфекция клетокКВЗ-1 и НСТ116кДНК YB
II. 8. Синтез и трансфекция siRNA/YB
II.9. Определение чувствительности клеток к цитостатикам
III. Результаты
III. 1. Исследование экспрессии и локализации белка YB-1 в культивируемых линиях чувствительных и резистентных к лекарственным препаратам
опухолевых клеток
III. 1. 1. Модели исследования
III. 1.2. Анализ уровня экспрессии мРНК/белка YB-1 в клетках с разными
уровнями лекарственной устойчивости
111.1.3. Исследование локализации белка YB-1 в парах чувствительных
и резистентных опухолевых клеток
III. 1.4. Сопоставление уровня экспрессии и локализации белка YB-I в парах чувствительных и резистентных опухолевых клеток с экспрессией
генов/белков МЛУ
III. 1.4.1. Анализ уровня экспрессии MDRl/Pgp
III.1.4.2. Определение уровня экспрессии генов/белков MRPI, BCRP, LRP
II 1.2. Влияние повышения экспрессии YB-1 на экспрессию генов/белков МЛУ и лекарственную устойчивость опухолевых клеток
111.2.1. Исследование влияния транзиторного введения YB
на лекарственную устойчивость опухолевых клеток
111.2.2. Исследование влияния транзиторного введения YB-1 на экспрессию
Pgp в условиях действия цитостатиков
111.2.3. Анализ влияния стабильной гиперэкспрессии YB-1 на экспрессию
генов/белков МЛУ
III. 2.4. Определение скорости пролиферации клонов клеток
с гиперэкспрессией YB
111.3. Влияние подавления экпрессии YB-1 на экспрессию генов/белков
МЛУ (эффекты siRNA/YB-1)
Ш.3.1. Подавление экспрессии эндогенного YB-1 и экспрессия генов МЛУ
111.3.2. Влияние подавления эндогенного YB-1 на пролиферацию клеток
111.4. Влияние химиотерапевтических препаратов на локализацию YB
в клетках и на экспрессию генов МЛУ
111.4.1. Влияние препаратов на локализацию YB-1 в клетках
111.4.2. Активация экспрессии генов МЛУ под действием цитостатиков
111.5. Определение уровня экспрессии мРНК YB-1 и белков МЛУ
у больных острым нелимфобластным лейкозом (ОНЛЛ)
IV. Обсуждение
V. Выводы
VI. Список литературы

специфическими моноклональными антителами UIC2 (МкАТ против внеклеточного домена Pgp).
Гиперэкспрессию мРНК гена MDR1 наблюдали в 5-ти из б-ти исследованных резистентных вариантов клеток (Рис.5А). В трех из исследованных клеточных линий (K562/Î-S9, КВ8-5, MCF-7/ADR) повышенный уровень экспрессии мРНК YB-1 коррелировал с гиперэкспрессией MDR1. Однако в 2-х других (mS-0.5, LIM1215/Act) линиях, в которых наблюдалась гиперэкспрессия MDR1, повышения экспрессии мРНК YB-1 выявить не удалось.
В пяти парах клеток исследовали экспрессию Pgp (К562 и K562/i-S9, КВЗ-1 и КВ8-5, MCF-7 и MCF-7/ADR, mS и mS-0.5, COR-23L/P и COR-23L/R). Повышенный уровень экспрессии Pgp наблюдали в 4х исследованных резистентных культурах клеток, хотя разница между уровнем экспрессии белка Pgp в чувствительных и резистентных вариантах клеток линий рака ротовой полости и молочной железы была менее выражена по сравнению с результатами ОТ-ПЦР анализа (Рис.5А, Г).
Для выявления характера окрашивания фиксированные на стекле клетки меланомы устойчивой линии mS-0.5 окрасили АТ к Pgp (UIC2). Можно видеть, что клеточная мембрана сильно прокрашивается (Рис.5В), что свидетельствует о высоком уровне экспрессии в этих клетках Pgp, который встроен в мембрану клеток.
III. 1.4.2. Определение уровня экспрессии генов/белков MRP1, BCRP, LRP.
Методом полуколичественной ОТ-ПЦР сравнивали уровень экспрессии мРНК различных генов МЛУ, включая MRP1, BCRP, LRP, в чувствительных и резистентных клетках. Методом проточной цитофлуориметрии определяли количество клеток, экспрессирующих белки MRP1, BCRP, LRP, окрасив клетки специфическими антителами.