Разработка и применение методов молекулярной биологии для выявления возбудителей бактериальных респираторных инфекций крупного рогатого скота

• Автор: Шибаев, Михаил Александрович
• Шифр специальности: 06.02.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Владимир
• Количество страниц: 165 с. : ил.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота ИФА - иммуноферментный анализ КОЕ - колонии образующая единица КРС - крупный рогатый скот

MJICT - мультилокусное секвенирование-типирование МРС - мелкий рогатый скот

МЭБ — всемирная организация здравоохранения животных

п. н. — пары нуклеотидов

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РНК - рибонуклеиновая кислота

СТ - секвенс-тип

ФБР - фосфатно - буферный раствор

ЦФО РФ - Центральный Федеральный округ Российской Федерации ЭТ - элементарные тельца
АТСС - американская коллекция типовых культур Chl.pecorum - Chlamydophila pecorum dNTP - дезоксинуклеотидтрифосфаты M.bovis - Mycoplasma bovis M.glucosida - Mannheimia glucosida M.haemolytica - Mannheimia haemolytica P.haemolytica - Pasteurella haemolytica P.multocida - Pasteurella multocida

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Этиопатогенез смешанных респираторных заболеваний
молодняка крупного рогатого скота
1.2. Роль отдельных бактериальных агентов в респираторной патологии молодняка крупного рогатого скота
1.2.1. Таксономия и структура Р. multocida, клинико-эпидемиологические собенности инфекции
1.2.2. Таксономия и структура M.haemolytica, клинико-эпидемиологические особенности инфекции
1.2.3. Таксономия и структура Chl.pecorum, клинико-эпидемиологические особенности инфекции
1.2.4. Таксономия и структура М. bovis, клинико-эпидемиологические особенности инфекции
1.3. Диагностика смешанных инфекций респираторного тракта молодняка крупного рогатого скота
1.3.1. Диагностика пастереллёза, вызываемого Р.multocida
1.3.2. Диагностика маннхеймиоза, вызываемого M.haemolytica
1.3.3. Диагностика хламидиоза, вызываемого Chl.pecorum
1.3.4. Диагностика микоплазмоза, вызываемого М.bovis
1.4. Заключение по обзору литературы
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Материалы
2.1.1. Биологические материалы
2.1.2. Химические реагенты
2.1.3. Растворы, буферные смеси и ферменты
2.1.4. Праймеры
2.1.5. Оборудование
2.2. Методы
2.2.1. Выделение суммарной ДНК
2.2.2. Мультиплексная ПЦР для индикации и дифференциации серогрупп А, В, 19, Е и Р Р.тиИос1с1а, рекомендованная МЭБ
2.2.3. Очистка продуктов ПЦР и секвестрование амплифицированных фрагментов ДНК
2.2.4. Компьютерный анализ и сравнение первичных
структур нуклеиновых кислот
2.2.5. Формирование выборки
2.2.6. Методы анализа данных
3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И
ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Разработка метода идентификации и дифференциации геномов
М.каето1уИса и Р.тиНос'Ма с помощью ПЦР и
нуклеотидного секвенирования
3.1.1. Выбор генетических мишеней и первичной структуры праймеров
3.1.2. Оптимизация условий постановки метода
3.1.3. Определение специфичности и аналитической чувствительности метода
3.1.4. Анализ вариабельности нуклеотидных последовательностей фрагментов генов яос1А и ИйЭ М. каето!уИса
выявленных на территории РФ в 2006-2009 гг
3.2. Разработка метода индикации генома СМ. ресогит с
использованием ПЦР
3.2.1. Выбор генетической мишени и первичной структуры праймеров
3.2.2. Генетический анализ и определение видовой принадлежности изолятов микроорганизмов семейства СЫатусИасеае
3.2.3. Оптимизация условий постановки и оценка специфичности метода
3.2.4. Анализ вариабельности нуклеотидных последовательностей фрагмента гена отрА СЫ.ресогит, выявленных на территории РФ в 2006-2009 гг
3.3. Разработка метода индикации генома МЬоуй с
использованием ПЦР
3.3.1. Выбор генетической мишени и первичной структуры
праймеров

До недавнего времени общепризнанным эталоном для прямых методов выявления хламидий считался метод выделения возбудителя в культуре клеток. Однако данный метод имеет целый ряд недостатков, существенно затрудняющих его широкое использование. Прежде всего, это риск инфицирования персонала. Кроме того, недостатком культурального метода является его длительность (6-10 дней) и трудоёмкость. Материал от инфицированного животного для высева патогена может храниться до проведения исследования в течение нескольких часов и не подвергаться замораживанию, поэтому успех исследования во многом зависит от скорости и соблюдения условий транспортировки проб в лабораторию (специальные транспортные среды, охлаждение, добавление антибиотиков и т.д.) [26,35,78,202].
В настоящее время культуральный метод всё чаще применяют в общей схеме анализа только на первом этапе накопления возбудителя, которого затем выявляют методами иммуноферментного анализа или иммунофлуоресценции, что существенно повышает специфичность исследования. Предпринимаются попытки заменить метод выделения хламидий в культуре другими методами прямого обнаружения, в частности, выявлением антигенов бактерий методом ИФА. Вместе с тем, ИФА-детекция антигенов хламидий, также как и культуральный метод, недостаточно специфична и чувствительна [26].
Также для диагностики хламидиозов животных используют методы ретроспективной диагностики, среди которых основное место занимает обнаружение в сыворотке крови инфицированных животных специфических антител методом ИФА, а также с помощью реакции- связывания комплемента, ранее применяемой для этих целей [ 47,151,216,223,]. Кро ме этого, в работах J. Salinas (1996) показана возможность применения реакции непрямой флуоресценции с использованием моноклональных антител при типировании Chl.pecorum [223]. Однако применение серологических методов во многом затрудняется вследствие перекрёстной реактивности основных