Изучение эффективности различных молекулярно-генетических методов идентификации и дифференциации возбудителей туберкулёза и атипичных микобактерий

• Автор: Хаммадов, Наиль Ильдарович
• Шифр специальности: 06.02.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Казань
• Количество страниц: 134 с. : ил.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВКО - внутренний контрольный образец ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
ДГ1 - 2Т - дезинфицирующий препарат трихлоризоциануровая кислота ИФА - иммуноферментный анализ
KAM - комплексный аллерген из атипичных микобактерий
МВТ - Mycobacterium tuberculosis
МФА - метод флуоресцирующих антител
НПФ - научно-производственная фирма
ОКО - отрицательный контрольный образец
ПДАФ - полиморфизм длин амплифицированных фрагментов
ПДРФ - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов
ПКО - положительный контрольный образец
ППД — протеин - пурифиед — дериват .
ППН - процент повреждения нейтрофилов ПЦР - полимеразная цепная реакция
ПЦР-ПДРФ - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов с продуктами полимеразной цепной реакции РА - реакция агглютинации
PBTJI - реакция бласт трансформации лимфоцитов
РГ — реакция гемолиза
РДП - реакция диффузной преципитации
РНГА - реакция непрямой гемагглютинации
РСК - реакция связывания комплимента
ТБЕ - трис - боратный буфер с бромистым этидием
Трис — гидрооксиметиламинометан
ЭДТА - динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты А — аденин
AFLP — amplified fragment long polymorphism (полиморфизм длин амплифицированных фрагментав)

AP PCR - arbitrary primed polymerase chain reaction (произвольно праймированная полимеразная цепная реакция)
С (Ц) - цитозин
dATP (дНТФ) - дезоксиадснозин трифосфат
dCTP (дЦТФ) - дезоксицитозин трифосфат
ddATP (ддАТФ) - дидезоксиаденозин трифосфат
ddCTP (ддЦТФ) - дидезоксицитозин трифосфат
ddGTP (дцГТФ) - дидезоксигуанидин трифосфат
ddTTP (ддТТФ) - дидезокситимидин трифосфат
dGTP (дГТФ) - дезоксигуанидин трифосфат
DNA - desoxyribonucleic acid
dNTP - дезоксинуклеотид трифосфат
DR - drag resistant (устойчивость к лекарствам)
dTTP - дезокситимидин трифосфат
ETR - exact tandem repeat (точный тандемный повтор)
HCV - hepatitis С virus
IS - insertion sequence (встраиваемая последовательность)
G (Г) - гуанин
MDR - drag resistant mycobacteria
MIRU - Mycobacterium interspersed repetitive reaction
Mycobacterium bovis BCG - Bacillus Calmette at Guerin
RAPD-PCR - random amplified polymorphic DNA polymerase chain reaction
SDS - Sodium dodecyl sulfate (додецил сульфат натрия)
T - тимин
Taq-DNA polymerase (Taq полимераза) - фермент для полимеризации ДНК, полученный из микроорганизма Termophylus aqaticus ТЕ- буфер - буфер трис ЭДТА
VNTR - variable number of tandem repeate (BHTP - вариабельное количество тандемных повторов)
ОГЛАВЛЕНИЕ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Основные свойства возбудителя туберкулёза
1.2. Иммунитет при туберкулезе
1.3. Методы диагностики туберкулёза
1.4. Молекулярно - генетические методы исследований при идентификации и дифференциации возбудителя
туберкулёза
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Материалы и методы исследований
2.1.1. Материалы исследований
2.1.2. Методы исследований
3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. Бактериологические исследования
3.2. Использование ПЦР тест-систем для индикации и дифференциации микобактерий
3.3. Полимеразная цепная реакция с применением различных произвольных праймеров для идентификации и дифференциации микобактерий
3.4. Анализ вариабельного количества тамдемных повторов при идентификации и дифференциации микобактерий
3.5. Применение геноспецифичных праймеров для идентификации микобактерий туберкулёзного комплекса и дифференциации Mycobacterium bovis BCG
3.6. Применение ПЦР-ПДРФ для дифференциации видов микобактерий
4. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ
5. ВЫВОДЫ

Интересующие фрагменты ДНК можно визуализировать путем электрофореза или молекулярной гибридизации с соответствующим зондом; данный метод хорошо известен в молекулярной биологии нуклеиновых кислот как блот-гибридизационный анализ. С его помощью полиморфные участки генома обнаруживаются в виде имеющих разную длину гомологичных фрагментов ДНК, которые образуются после гидролиза геномной ДНК рестриктазами. Этот феномен получил название полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) ДНК (Иванов П.Л., 2003).
Актуальным методом изучения полиморфизма ДНК стал метод ГГТТР-ПДРФ, который, в отличие от метода AFLP, сначала амплифицирует исследуемую ДНК, а потом её подвергает действию различных рестриктаз. Данный метод широко применяется при геномной «дактилоскопии» организмов, при анализе точечных мутаций, приводящих к различным наследственным порокам, а также напрямую или косвенно связанных с хозяйственно-полезными признаками (Смирнов Г.Б., 2008; Сулимова F.E.,. 1993; Asakura N., 2009; Fan L.L., 2009).
При оптимальном выборе амплифицируемой нуклеотидной последовательности этот метод характеризуется высокой разрешающей силой. Примером таких продуктов амплификации может служить ген katG у М. tuberculosis (Brow М., 1996; Caws М., 2007; Winje В.А., 2008).
Наиболее разрешающим методом дифференциации штаммов M.tuberculosis признано типирование по ПДРФ IS6110. Благодаря стандартизации этого метода J.D. Van Embden с соавт. в 1993 г. и разработке программного обеспечения, стало возможно создание международных баз данных, содержащих информацию о IS6110-профилях гибридизации штаммов M.tuberculosis, циркулирующих в различных регионах мира, что позволило, во-первых, проследить пути миграции штаммов, и, во-вторых, на основании сходства профилей гибридизации сгруппировать известные штаммы в кластеры (Ченоусова JI.H, 2001).