Изучение первичной структуры генома изолятов вируса высокопатогенного гриппа птиц A/H5N1, выделенных на территории Российской Федерации

• Автор: Новикова, Мария Викторовна
• Шифр специальности: 06.02.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Покров
• Количество страниц: 205 с. : ил.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

а. о. - аминокислотный остаток

АР - автономная Республика

ВГ - вирус гриппа

ВГП - вирус гриппа птиц

ВОЗ - всемирная организация здравоохранения

ВПГП - высокопатогенный грипп птиц

ГП - грипп птиц

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

кДНК - ДНК-копия с РНК матрицы

КЧП - классическая чума птиц
КЭ - куриный эмбрион
н. п. - нуклеотидная пара
н. о. - нуклеотидное основание
ОРВИ - острая респираторная вирусная инфекция
ОТ - обратная транскрипция
ОРС - открытая рамка считывания
п/ф - птицефабрика
ПЦР - полимеразная цепная реакция
РНК - рибонуклеиновая кислота
РНП - рибонуклеопротеин
РСС - рецептор связывающий сайт
ФБР - фосфатно-буферный раствор
ЭЭЖ - экстра эмбриональная жидкость
с11ЧТР - дезоксинуклеотидтрифосфаты
НА - белок гемагглютинин
КА - белок нейраминидаза
01Е - всемирная организация здравоохранения животных
8РБ - свободный от специфических патогенов
УЬА - Ветеринарное лабораторное агентство, г. Вейбридж, Англия

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Историческая справка о вирусе гриппа птиц
1.2. Распространение высокопатогенного гриппа птиц в мире
1.3. Классификация и номенклатура вируса гриппа птиц
1.4. Структура вириона вируса гриппа птиц
1.5. Репликация вируса гриппа птиц
1.6. Вирус гриппа у диких водоплавающих птиц
1.7. Вспышки ВПГП/Н5№среди диких и домашних птиц в России
1.8. Клинические признаки, патологоанатомические изменения и патогенез при гриппе птиц
1.9. Биологические свойства вируса гриппа птиц
1.9.1. Молекулярные детерминанты хозяйской специфичности
вируса гриппа птиц
1.9.2. Гемагглютинин как генетический маркер патогенности
1.9.3. Использование данных о структуре белков вируса для профилактики высокопатогенного гриппа птиц Н5К1
1.10 Молекулярная диагностика гриппа птиц
1.10.1. Диагностика гриппа птиц с помощью классической ОТ-ПЦР
1.10.2. Диагностика гриппа птиц с помощью ОТ-ПЦР в режиме
| реального времени
1.11. Заключение по обзору литературы
I 2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Материалы и оборудование
2.1.1. Вирус гриппа птиц

2.1.2. Нуклеотидные последовательности ВГП
2.1.3. Коммерческие наборы, ферменты
2.1.4. Растворы, буферные смеси, реагенты
2.1.5. Праймеры

2.1.6. Оборудование и расходные материалы
2.2. Методы исследования
2.2.1. Подбор праймеров для ОТ-ПЦР
2.2.2. Экстракция суммарной РНК
2.2.3. Обратно-транскриптазная полимеразная цепная реакция
2.2.4. ОТ-ПЦР в режиме реального времени
2.2.5. Учет результатов ОТ-ПТТР
2.2.6. Очистка продуктов ПНР
2.2.7. Определение нуклеотидной последовательности амплифицированных фрагментов к ДНК
2.2.8. Компьютерный анализ и сравнение первичных структур нуклеиновых кислот
3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Определение первичной структуры генома изолятов вируса ВПГП Л/Н5Ы1 генетической подгруппы (21га1 с помощью ОТ-ПЦР и нуклеотидного секвенирования
3.2. Выбор праймеров для амплификации фрагментов генома изолятов вируса ВПГП/Н5М1 подгруппы (Зт§йа1
3.3. Оптимизация метода определения первичной структуры генома изолятов вируса ВПГП А/Н5Т41 генетической подгруппы (йа! с помощью ОТ-ПЦР и нуклеотидного секвенирования
3.4. Генетический анализ изолятов вируса ВПГП/Н5Ц1
3.5. Разработка метода определения генетических маркеров изолятов вируса ВПГП/Н5К1, выделенных в России
3.5.1. Филогенетический анализ вирусов ВПГП/Н5Ш, выделенных
на территории РФ в 2008-2009гг
3.5.2. Выбор праймеров для амплификации фрагментов генома изолятов вируса ВПГП/Н51Ч1

штаммы вируса не обязательно патогенны для птиц всех видов и клиническое проявление и тяжесть болезни у разных хозяев варьирует в зависимости от их вида и возраста [19, 21, 23, 34].
1.9.1. Молекулярные детерминанты хозяйской специфичности вируса гриппа птиц Гемагглютинин. Гликопротеин НА содержит основную детерминанту ограничения хозяйской специфичности, поскольку играет ведущую роль в распознавании клеток организма-мишени. Рецепторная специфичность ВГ варьирует в зависимости от вида организма, от которого выделили вирус.
Что касается организма человека, то ВГ распознают
сиалилолигосахариды, заканчивающиеся N-ацетилсиаловой кислотой, связанной с галактозой а2,6 связью (NeuAca2,6Gal), вирусы птиц и лошадей распознают N-ацетилсиаловую кислоту, связанную с галактозой а2,3 связью (NeuAca2,3Gal) [31, 139, 140, 147, 154]. Это означает, что превалирующие связи сиаловой кислоты с галактозой сиалилолигосахаридов в эпителиальных клетках в вирусных репликационных сайтах отличаются у различных видов животных. Например, эпителиальные клетки трахеи человека содержат в основном NeuAca2,6Gal-CB43b, в эпителиальных клетках трахеи лошади и кишечнике уток преобладает NeuAca2,3Gal-CBB3b [112].
Следует отметить, что эпителиальные клетки трахеи свиней содержат оба вида связи: NeuAea2,6Gal, и NeuAca2,3Gal [112], этим можно объяснить высокую восприимчивость организма этих животных к ВГ человека и птиц. Таким образом, на хозяйскую специфичность вирусов гриппа может влиять наличие двух типов связей галактозы с сиаловой кислотой сиалилолигосахаридов на клеточной поверхности. Такие различия в специфичности определяются структурой гемагглютинин-РСС: например, аминокислота Leu в позиции 226 ВГ человека подтипа НЗ заменяется на аминокислоту Gin в той же позиции вирусов лошадей и птиц, что и определяет специфичность NeuAca2,6Gal-cB43H [139]. В нескольких работах