Изучение структуры и свойств пептидил-пролил-цис/транс-изомеразы MF3, индуцирующей устойчивость растений к болезням

• Автор: Шумилина, Дарья Владимировна
• Шифр специальности: 06.01.11
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Большие Вяземы
• Количество страниц: 109 с. : ил.

Глава 1. Обзор литературы
1.1. Белки и их роль во взаимоотношениях хозяин-патоген
1.1.1. Индуцирование устойчивости растений неспецифическими
элиситорами
1.1.2. Индукция устойчивости растения продуктами 11-генов

(специфических элиситоров)
1.2. Индуцированная устойчивость растений к болезням
1.3. Применение веществ белковой природы для защиты растений от

патогенов и вредителей
1.3.1. Белки-токсины бактериального происхождения
1.3.2. Растительные белки
1.4. Трансгенные растения, устойчивые к вирусам
1.5. Изменение метаболизма растительных тканей, как способ

повышения устойчивости растений к патогенам
1.6. Пептидил-пролил-гщс/шранс-изомеразы
1.6.1. ППИ-азы растений
1.6.2. ППИ-азы паразитических организмов
1.6.3. Влияние ППИ-аз хозяина на развитие патогенов
1.6.4. Использование ППИ-аз для подавления развития патогенов
Глава 2. Материалы и методы

2.1. Материалы
2.2. Методы
Глава 3. Результаты исследований и их обсуждение
3.1. Определение количества МРЗ в клетках Р. Аиогеьсет^ 197)
3.2. Создание штамма Е. соИ -суперпродуцента МРЗ
3.3. Исследование фитотоксичности МРЗ
3.4. Изучение влияния МРЗ на вирусные патогены растений
3.4.1. Вирус табачной мозаики
3.4.2. У-вирус картофеля
3.5. Изучение влияния МРЗ на грибные патогены растений
3.5.1. АИетапа longipes
3.5.2. Возбудители корневых гнилей злаковых
3.6. Изучение возможности использования хитозанов для улучшения
проникновения МРЗ в растительные ткани
3.6.1. Изучение способности МРЗ в смеси с хитозанами индуцировать
устойчивость пшеницы к патогенному грибу Stagonospora пойогит
о /: у
' ' Изучение способности МРЗ в смеси с хитозанами индуцировать
устойчивость растений белокочанной капусты к вирусу мозаики турнепса
3-7- Анализ нуклеотидной последовательности гена и аминокислотной
последовательности белка МРЗ

3.7.1. Поиск и изучение элиситорного центра МРЗ белка - ППИ-азы РКВР-типа, выделенного из Р. Аиогехсет
3.8. Изучение трансгенных растений, несущих ген МРЗ белка
3.8.1. Молекулярный анализ трансгенных растений
3.8.2. Оценка устойчивости трансгенных растений рапса и цветной
капусты к фитопатогенам
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 3. Результаты исследований и их обсуждение.
К началу наших исследований сотрудником лаборатории молекулярной биологии ВНИИФ Т.М. Воиновой был проведён скрининг различных бактерий, способных индуцировать устойчивость растений к патогенам и отобран наиболее эффективный штамм Р. Аиогеьсет №197, применение которого на вегетирующих растениях приводило к повышению их устойчивости к возбудителям болезней. Для того чтобы определить факторы, вызывающие устойчивость растений при применении Р. /Ыогеясет №197, использовали не только живую культуру бактерии, но и экстракты, полученные из разрушенных клеток. Для определения химической природы действующего вещества проводилась обработка экстрактов из разрушенных клеток Р. Аиогеьсет различными ферментами. Отсутствие элиситорной активности у обработанных ферментом протеиназой К экстрактов свидетельствовало о том, что их действующее вещество имело белковую природу. Данный белок был выделен, секвенирован и получил название Микробный Фактор З (МБЗ). Было показано, что МБЗ термостабилен, в то время как после кипячения экстракта на водяной бане в течение 20 минут другие белки денатурировали и выпадали в осадок, этот белок сохранял растворимость и способность индуцировать устойчивость табака к вирусу табачной мозаики (ОгЬауакІїіа е/ а1,2005).
3.1. Определение количества МБЗ в клетках Р./Іиогезсет (197)
Для того чтобы определить количество МБЗ, синтезирующегося в клетках Р./Іиогеясет штамма 197, использовали бактериальную культуру оптическая плотность которой при разбавлении вдвое составляла 0,38. МБЗ выделяли из 40 мл бактериальной культуры. Для этого бактериальные клетки центрифугированием отделяли от питательной среды и промывали 0,1М ЫаС1 для удаления её остатков. Промытые клетки суспендировали в 50 мл буфера (50 мМ Трис-НС1, pH 8.0, 0,15 мМ КаС1, 2мМ ЭДТА и лизоцим 2мкг/мл) и инкубировали во льду в течение 30 мин. Затем колбу с суспензией помещали на 20 мин в кипящую водяную баню (100°С). По истечении этого времени колбу переносили в лёд для быстрого охлаждения. Охлаждённую суспензию центрифугировали при 4000 g в течение 30 мин. Осветлённый клеточный лизат