Получение трансгенных растений табака с геном белка CspD из Bacillus thuringiensis и изучение элиситорных свойств бактериальных белков холодового шока

• Автор: Кромина, Ксения Андреевна
• Шифр специальности: 06.01.11
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Большие Вяземы
• Количество страниц: 124 с. : ил.

Глава 1. Обзор литературы

Терминология

1.1. Устойчивость растений к болезням

1.2. Индуцированная устойчивость растений, ее виды

1.2.1. Системная приобретенная устойчивость

1.2.2. Системная устойчивость, индуцируемая ризосферными бактериями

1.2.3. Спектр генов арабидопсиса, экспрессируемых при активации защитных ответов на некрозообразующий патоген, салициловую кислоту, метилжасмонат и этилен

1.3. Элиситоры устойчивости растений к болезням

1.3.1. Элиситоры общих защитных отетов растений

1.3.1.1. Флагеллин

1.3.1.2. Бактериальный фактор элонгации

1.3.1.3. Бактериальные белки холодового шока
1.3.1.4. Консервативная область трансглютаминаз видов рода Phytophthora - пептид Рер
1.3.1.5. Липополисахариды
1.3.1.6. Пептидил-пролил цисгрансизомераза из бактерии Р. fluorescens
1.3.1.7. Хитин и хигозаны
1.3.2. Элиситоры устойчивости растений, участвующие в процессе взаимодействия растение - патоген
1.3.2.1. Факторы авирулентности
1.3.2.2. Харпины
1.4. Механизмы распознавания растением химических детерминант микроорганизмов
1.4.1. Молекулярные детерминанты патогена, PAMPs
1.4.2. Распознавание PAMPs у животных и растений
1.4.3. Распознавание растением факторов авирулентности патогена
1.4.4. Доступность PAMPs для растений
1.5. Практическое применение индуцированной устойчивости растений для их защиты от болезней
1.5.1. Обработка растений индукторами устойчивости
1.5.2. Создание трансгенных растений, устойчивых к фитопатогенам
1.5.2.1. Экспрессия в трансгенных растениях генов антимикробных веществ
1.5.2.2. Экспрессия в растениях R-генов близкородственных растений
1.5.2.3. Экспрессия в растениях генов элиситоров, вызывающих реакцию СВЧ
Глава 2. Материалы и методы исследований
2.1. Материалы
2.1.1. Химические реактивы и ферменты, использованные в работе
2.1.2. Бактериальные штаммы
2.1.3. Плазмиды
2.1.4. Фитопатогенные микроорганизмы
2.1.5. Пептид cspl5
2.1.6. Суспензионная культура клеток табака
2.2. Методы
2.2.1. Трансформация табака методом «листовых дисков»
2.2.2. Генетический анализ трансгенных растений поколения Т1
2.2.3. Выделение растительной геномной ДНК
2.2.4. Полимеразная цепная реакция
2.2.5. Выделение тотальной РНК
2.2.6. Анализ экспрессии CspD гена на уровне синтеза мРНК с помощью обратной транскрипции с последующей ПЦР
2.2.7. Определение уровня экспрессии целевого гена с помощью ПЦР в реальном времени
2.2.8. Выращивание трансгенных растений табака в климатической камере
2.2.9. Культивирование гриба Altemaria longipes (Ellis & Everh.)
2.2.10. Оценка трансгенных растений табака на устойчивость к патогенному грибу A. longipes
2.2.11. Оценка трансгенных растений табака на устойчивость к вирусу табачной мозаики
2.2.12. Оценка активности пептида cspl5 в системе табак - ВТМ
2.2.13. Изучение скорости СВЧ реакции в тканях картофеля при несовместимом взаимодействии после обработки пептидом cspl5
2.2.14. Изучение влияния пептида cspl5 на прорастание спор гриба Stagonospora nodorum
2.2.15. Проверка активности пептида cspl5 с использованием пары пшеница - возбудитель септориоза (S. nodorum)
2.2.16. Инфильтрация пептида cspl5 в межклеточное пространство листьев табака
2.2.17. Определение содержания салициловой кислоты в тканях картофеля, обработанных пептидом cspl5
2.2.18. Измерение защелачивания питательной среды в суспензионной культуре клеток табака после обработки элиситором
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Глава 3. Анализ нуклеотидной и аминокислотной последовательностей гена и белка MF2 (CspD, номер в GenBank AY272058)
3.1. Анализ первичной структуры нуклеотидной и аминокислотной последовательностей гена и белка MF2
3.2. Анализ нуклеотидной последовательности гена СврБ с целью определения возможности его эффективной экспрессии в растениях табака

Глава 4. Получение трансгенных растений табака с геном Орй Биотесты с трансгенными растениями
4.1. Конструирование бинарного вектора рШк7, несущего бактериальный ген ОрД для трансформации растений
4.2. Агробактериальная трансформация
4.3. Молекулярный анализ трансгенных растений
4.4. Сравнение уровня экспрессии в трансгенных линиях табака с помощью ПЦР в реальном времени
4.5. Определение числа локусов в геноме растений, в которые произошла вставка Т-ДНК. Наследование вставки в поколении Т1
4.6. Оценка устойчивости трансгенных растений табака
4.6.1. Оценка трансгенных растений табака на устойчивость к патогенному грибу А 1ощрс$
4.6.2. Оценка трансгенных растений табака на устойчивость к вирусу табачной мозаики
Глава 5. Изучение элиситорных свойств пептида с$р15
5.1. Исследование способности пептида сэр 15 индуцировать устойчивость в системах растение-хозяин - патоген
5.1.1. Оценка активности пептида с$р15 в системе табак - ВТМ
5.1.2. Изучение скорости СВЧ реакции в тканях картофеля при несовместимом взаимодействии с патогеном после обработки пептидом
5.1.3. Изучение влияния пептида «р15 на прорастание спор 5. пос!огит
5.1.4. Проверка защитной активности пептида стр15 в паре пшеница -5. пос1огит
5.2. Изучение защитных реакций растения в ответ на обработку пептидом свр15
5.2.1. Инфильтрация пептида СБр 15 в межклеточное пространство листьев табака для обнаружения его способности вызывать реакцию СВЧ
5.2.2. Анализ содержания салициловой кислоты в тканях картофеля, обработанных пептидом сяр15
5.2.3. Оптимизация методики тестирования ранних защитных ответов растения в суспензионной культуре клеток табака. Проверка активности пептида сяр15 в культуре клеток табака
ВЫВОДЫ
СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЯ
Приложение 1. Бактериальный штамм Bacillus ihuringiensis VNPB-17-3. Приложение 2. Описание патогена AIternaria longipes (Ellis & Everh.).... Приложение 3. Описание патогена Slagonospora nodorum

чего располагали их на питательной среде А2 верхней стороной листа вниз. В течение трех дней держали чашки Петри в климатической камере затененными. Через три дня листовые диски промывали в чашках Петри жидкой средой А2, содержащей 500 мг/л карбенициллина. После промывания подсушивали листовые диски на стерильном фильтре и помещали их на среду АЗ (МС-соли; 2,0% глюкоза; 0,3% фитогель, 0,1 мг/л никотин-уксусная кислота [НУК]; 1,0 мг/л бензиламинопурина (БАП); pH 5,5), содержащую канамицин - 100 мг/л и карбенициллии - 500 мг/л. Каждую неделю перекладывали экспланты на свежую среду АЗ, содержащую канамицин и карбенициллии в тех же концентрациях. Через 3-4 недели образовавшийся каллус отделяли от эксплантов и помещали на среду А4 (то же что и АЗ, но без НУК) с канамицином и карбенициллином. Через 3-4 недели регенерировавшие побеги срезали с каллуса и помещали на среду А5 ('Л МС-солей; 3,0% сахароза; 0,3% фитогель; канамицин 100 мг/л и карбенициллии 500 мг/л) для укоренения.
2.2.2. Генетический анализ трансгенных растений поколения Т1.
Для проведения анализа, растения ТО, имеющие вставку гена, выращивали до цветения и проводили самоопыление. Семена трансгенных растений помещали в мешочек из фильтра “МпасЫЬ” и дезинфицировали, выдерживая семена сначала 2 минуты в 70% этаноле, затем 20 минут в растворе коммерческого отбеливателя «Белизна» разведенного водой 1:10, после чего трижды обильно промывали семена стерильной водой. Полученные семена Т1 высевали на питательную среду (1/2 МС) с селективным агентом канамицином (100 мг/л). В качестве контроля использовали семена нетрансгенных растений, а в качестве дополнительного контроля на всхожесть семян использовали питательную среду без канамицина. Подсчитывали количество устойчивых (зеленых) и неустойчивых (белых) к канамицину растений. Достоверность расщепления определяли методом хи-квадрат.