Диагностика Y-вируса картофеля и штаммовый состав патогена в Среднем Поволжье

• Автор: Вологин, Семен Германович
• Шифр специальности: 06.01.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 138 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Вирусные болезни картофеля

1.2 Характеристика вирусов картофеля

1.2.1 Х-вирус картофеля

1.2.2 М-вирус картофеля

1.2.3 Вирус скручивания листьев картофеля

1.2.4 У-вирус картофеля

1.3 Диагностика вирусных патогенов

1.3.1 Визуальное выявление вирусов
1.3.2 Метод биологического тестирования
1.3.3 Электронная микроскопия
1.3.4 Иммунобиологические методы диагностики
1.3.5 Молекулярно-генетические методы исследования
ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1 Объект исследования
2.2 Учетные точки исследований
2.3 Способы разрушения растительного материала
2.4 Преаналитическая подготовка растительного материала
2.5 Условия выращивания растений в защищенном грунте
2.6 Идентификация штаммовой принадлежности УВК
2.7 Искусственное заражение растений картофеля и табака
2.8 Методика проведения ИФА
2.9 Перечень реактивов использовавшихся
при проведении ИФА
2.10 Методика проведения ОТ-ПЦР

2.11 Конструирование олигонуклеотидных праймеров и определение нуклеотидной последовательности ДНК
2.12 Математическая обработка результатов
ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 Преаналитическая подготовка растительного материала для проведения диагностических исследований
3.1.1 Анализ структуры листовых и клубневых проб
картофеля
3.1.2 Влияние состава биоматериала и условий температурного хранения
3.1.3 Влияние буферных соединений
3.1.4 Действие антисептических соединений
3.1.5 Алгоритм преаналитической подготовки
биоматериала
3.2 Мониторинг вирусных патогенов в условиях
открытого грунта
3.3 Диагностика вирусов в меристемных линиях картофеля
3.4 Биометрический анализ данных ИФА
3.4.1 Анализ неинфицированных образцов
3.4.2 Расчет величины порогового значения
3.4.3 Анализ ГАТГ-инфицированных образцов
3.5 Структура популяции УВК в Среднем Поволжье
3.5.1 Оценка частоты распространения серотипов вируса
3.5.2 Идентификация изолятов УВК
3.5.3 Идентификация возбудителя кольцевого некроза
клубней картофеля
3.5.4 Поиск сайтов рекомбинации в геноме изолятов УВК

3.5.5 Анализ нуклеотидной последовательности СР-гена и
белка оболочки УВК
ВЫВОДЫ
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ПРИЛОЖЕНИЕ

Для одновременного обнаружения нескольких вирусов картофеля в одной исследуемой пробе создана система мультиплексной ОТ-ПЦР, основанная на участии в реакции нескольких пар праймеров [Nie, Singh, 2001]. Применяются высокочувствительные подходы проведения амплификационного тестирования: ПЦР «в реальном времени» (Real-time PCR) [Agindotan et al., 2007] и метод флуоресцентного определения продуктов реакции по конечной точке (Flach-PCR) [Рязанцев, Завриев, 2009]. Эти методы проведения детектирования результатов ПЦР не требуют открывания пробирок с реакционной смесью, в связи с чем, ликвидирована возможность контаминации ДНК-амплификонами.
В настоящее время разработаны подходы, которые объединяют принципы иммуноанализа и генодиагностики. К числу таких методов можно отнести иммуносорбентную ПЦР (IC-PCR), применение которой было использовано при диагностике YBK на ротовом аппарате насекомых-переносчиков [Varveri, 2000]. Диагностическая система ОТ-ПЦР-МГА-ИФА, объединила способы молекулярной гибридизации, амплификационного синтеза и иммуноанализа [Drygin et al., 2007].
Современные способы диагностики и идентификации вирусных патогенов, в основном, базируются на технологиях ИФА и ПЦР. Эти технологии постоянно совершенствуются в плане чувствительности, надежности и простоты исполнения [Защита картофеля..., 2009]. Таким образом, область современной диагностики фитопатогенов приобретает черты динамично-развивающейся системы.