Количественный анализ культуральных жидкостей штаммов-продуцентов промышленных антибиотиков различных классов методом высокоэффективной тонкослойной хроматографии

• Автор: Антонова, Светлана Владимировна
• Шифр специальности: 05.11.11
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 161 с. : ил.

Содержание:
1. Введение

2. Литературный обзор

2.1. Обоснование выбора метода для анализа антибиотиков

2.2. Стационарные фазы в ТСХ

2.3. Подвижные фазы в ТСХ

2.4. Стратегия выбора и оптимизации подвижных фаз в ТСХ

2.5. Обнаружение соединений на хроматограммах

2.6. Количественная обработка результатов методом денситометрии

2.7. Инструментальные способы измерения

2.8. Электроосмотическая ТСХ (ЭО-ТСХ)

2.9. Анализ погрешности определения в ТСХ
3. Техника и методика проведения эксперимента
3.1. Приборы и материалы
3.2. Реактивы
3.3. Приготовление стандартных образцов антибиотиков и проб КЖ
3.3.1. Тилозин
3.3.1.1. Экстракция тилозина бутилацетатом
3.3.1.2. Экстракция тилозина бутилацетатом с добавлением неорганических солей
3.3.2. Вирджиниомицин
3.3.3. Моеномицин
3.3.4. Биалафос
3.3.5. Фосфомицин
3.4. Подготовка хроматографических пластинок
3.5. Хроматографические системы, используемые в работе и их приготовление
3.6. Подготовка хроматографической камеры
3.7. Приготовление обнаруживающего реагента
3.7.1. Раствор нингидринового реактива
3.7.2. смесь хлорсульфоновой и уксусной кислот (2+1, у/у)
3.7.3. Растворы для визуализации фосфомицина
3.8. Нанесение стандартных образцов и проб КЖ на хроматографическую пластинку
3.9. Нанесение стандартных образцов и проб КЖ на хроматографическую пластинку для ЭО-ТСХ
3.10. Элюирование хроматограмм
3.11. Электроосмотическая
3.12. Обработка хроматограммы обнаруживающим реагентом
3.12.1. Нингидриновым реактивом
3.12.2. Смесью хлорсульфоновой и уксусной кислот
3.12.3. Обработка хроматограммы растворами I и II для визуализации фосфомицина
3.13. Количественная обработка хроматограмм
3.14. Исследование степени экскретирования антибиотика клетками
3.15. Определение содержания антибиотиков методом диффузии в агар
3.16. Проведение биоавтографии
3.17. Определение содержания тилозина методом ВЭЖХ
3.18. Определение содержания вирджиниомицинов методом ВЭЖХ
3.19. Определение содержания моеномицинов методом ВЭЖХ
3.20. Определение биалафоса и сопутствующих ему в КЖ веществ методом ВЭЖХ
3.21. Очистка культуральной жидкости штамма-продуцента фосфомицина в
препаративных количествах
3.21.1. Центрифугирование культуральной жидкости
3.21.2. Депигментировапие культуральной жидкости
3.21.3. Мембранные методы очистки КЖ штамма-продуцента фосфомицина
3.21.3.1. Микрофильтрация
3.21.3.2. Ультрафильтрация

3.22. Количественное определение фосфомицина методом капиллярного
электрофореза
4. Результаты и обсуждение
4.1. Количественное определение тилозииа и сопутствующих ему макролидов в КЖ
4.1.1. Изучение влияния процесса культивирования продуцента тилозина на распределение антибиотика при экстракции бутилацетатом из КЖ
4.1.2. Изучение распределения антибиотика тилозина между нативной КЖ и бутилацетатом в присутствии неорганических солей
4.2. Анализ вирджиниомицинов в промышленных образцах КЖ
4.3. Хроматографическое определение моеномицинов в образцах КЖ из различных промышленных партий
4.4. Анализ биалафоса и сопутствующих ему предшественников в КЖ
4.4.1. Выбор оптимальных условий проведения цветной реакции для визуализации пятен ВА и БТ на хроматограммах
4.5. Фосфомицин
4.5.1. Количественное определение фосфомицина в КЖ методом ТСХ
4.5.1.1. Визуализация пятен фосфомицина на хроматограмме
4.5.1.2. Количественная обработка хроматограмм
4.5.1.3. Изучение влияния аэрации на уровень биосинтеза фосфомицина
4.5.2. Очистка КЖ штамма-продуцента фосфомицина в препаративных количествах
4.5.3. Определение содержания фосфомицина в КЖ методом капиллярного электрофореза
4.5.3.1. Подготовка пробы КЖ для проведения анализа методом КЭ
4.5.3.2. Оптимизация пробоподготовки образцов КЖ
4.5.3.3. Изучение кислотного гидролиза фосфомицина методом КЭ
4.6. Исследование полноты экскретирования антибиотиков из клетки
4.7. Элсктроосмотическая ТСХ
4.8. Предвалидационные тесты
лет выпускает приборы, предназначенные для погружения хроматограмм в раствор обнаруживающего реагента (рис. 2-5-2); минимальное время экспозиции такого прибора - 1 сек.; серийно производятся также и камеры для ручного погружения хроматограмм [13, 27, 50, 56].
Рис. 2-5-2. Прибор для нанесения обнаруживающего реагента на хроматограмму методом погружения; внешний вид [13, 51].
К недостаткам метода погружения можно отнести:
- изменение состава и загрязнение раствора обнаруживающего реагента при длительном использовании;
- размывание хроматографических зон при больших временах экспозиции (более 1 мин.) и (или) использовании сильно полярных растворителей.
Последний недостаток легко устраним путем предварительного погружения хроматограммы в н-бутанол (5 сек.), с последующим высушиванием [33, 54, 60]. Для приготовления растворов обнаруживающих реагентов, предназначенных для обработки хроматограмм методом погружения используется менее полярный растворитель, и концентрация этих растворов, как правило, в 2-4 меньше, чем у растворов тех же реагентов, которые используются при опрыскивании хроматограмм [29, 54].
Данные об обнаруживающих реагентах, методах нанесения, условиях проведения цветных реакций более подробно можно посмотреть в литературных источниках. [42, 54, 61, 62].