Экспрессия генов сигнального пути Wnt при регенерации у голотурии Eupentacta fraudatrix

• Автор: Гирич, Александр Сергеевич
• Шифр специальности: 03.03.05
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Владивосток
• Количество страниц: 116 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Регенерация

1.2. Регенерация у иглокожих

1.3. Регенерация у ЕигЕЫтлстл Р1ыиоАтш

1.4. Молекулярные механизмы регенерации

1.5. Гены семейства Уыт

1.6. Структура белков Уыт

1.7. Типы сигнального пути У/ит

1.8. Функции Уит

1.9. Молекулярные механизмы регенерации у иглокожих
1.10. Роль \0чт в регенерации у иглокожих
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Сбор материала
2.2. Иммуноцитохимия
2.3. Анализ транскриптомов
2.4. Быстрая амплификация концов кДНК
2.5. Электрофорез ДНК
2.6. Лигирование и трансформирование
2.7. Секвенальная реакция
2.8. Филогения
2.9. Локализация экспрессии
2.10. ПЦР в реальном времени
3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Распределение белка Vnt5 в тканяхЕ. риАиолтшхъ норме
3.2. Распределение белка Vnt5 в тканях Е. рялиоАтшхъ процессе регенерации после эвисцерации
3.3. Биоинформационный анализ транскриптов генов сигнального пути
VNIT, ИМЕЮЩИХСЯ В ТРАНСКРИПТОМАХ РЕГЕНЕРИРУЮЩИХ ОРГАНОВ Е.
РЯгНЮАТМХ
3.4. Экспрессия гена vntA в норме регенерации Е. рюнюатюх
3.5. Экспрессия гена vnt4 в норме и регенерации Е. ркАиоАТМх
3.6. Экспрессия гена vnt6 в норме и регенерации Е. РЯАиолтшх
3.7. Экспрессия гена vnt16 в норме и регенерации Е. рмиолтш
4. ОБСУЖДЕНИЕ

4.1. Гены семейства Уот
4.2. РОЛЬ ГЕНА ШТ4 ПРИ РЕГЕНЕРАЦИИ Е. РЯАиОАТЮХ
4.3. РОЛЬ ГЕНА ШТб ПРИ РЕГЕНЕРАЦИИ Е. РЯЛиРАТШ
4.4. РОЛЬ ГЕНА ШТА ПРИ РЕГЕНЕРАЦИИ Е. РЮШПАТШХ
4.5. Роль ГЕНА (ГАГ/6 ПРИ РЕГЕНЕРАЦИИ Е. РМиОАТШХ
4.6. РОЛЬ VNT5 ПРИ РЕГЕНЕРАЦИИ У Е. РЯЛиОАТЫХ
4.7. Роль ДРУГИХ ГЕНОВ СИГНАЛЬНОГО ПУТИ VrJT ПРИ РЕГЕНЕРАЦИИ У Е. РкЛиРЛТЮХ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы. Одним из важнейших компонентов морфогенетических механизмов являются сигнальные молекулы. Они взаимодействуют со специфическими рецепторами и запускают каскад внутриклеточных реакций, активирующих целевые гены. Примером таких сигнальных молекул могут служить белки семейства Wnt. Запускаемый ими каскад реакций, сигнальный путь Wnt, участвует в регуляции многих биологических процессов, в частности, формировании осей тела в эмбриогенезе, развитии ряда органов, регенерации и канцерогенезе (Logan, Nüsse, 2004; Reya, Clevers, 2005; Poustka et al., 2007; Mashanov et al., 2012b). Гены wnt выявлены у всех многоклеточных животных, от губок до насекомых и млекопитающих. Число их у разных видов различно и может варьировать от 1 -3 (губки) до 19 (млекопитающие) (Schubert et al., 2000; Adamska et al., 2007). Кроме белков Wnt, выполняющих роль лигандов, в состав сигнального пути Wnt входят рецепторы Frizzled и LRP5/6, а также внутриклеточные мессенджеры Dishevelled и ß-catenin (Komiya, Habas, 2008). Большое число wnt и их участие в широком спектре биологических процессов указывает на важность сигнального пути Wnt в жизнедеятельности многоклеточных животных.
Одной из важнейших функций сигнального пути Wnt является регуляция восстановительных процессов. Регенерация является универсальной адаптацией к повреждающему действию окружающей среды и свойственна в той или иной степени всем живым организмам (Лиознер, 1982; Карлсон, 1986). Показано, что у планарий экспрессия wntl и wnt2 имеет градиентный характер (Petersen, Reddien, 2009). При нарушении этого градиента в результате повреждения запускается сложный каскад реакций, направленный на восстановление утраченной части животного. У млекопитающих гены wnt регулирует процесс восстановления кончиков фаланг пальцев (Takeo et al., 2013). При ингибировании сигнального пути Wnt восстановление не

соединительной ткани зачатка АК. К 24 сут регенерации локализация экспрессии данного гена сходна с нормой, его транскрипты не обнаруживаются в АК и кишке (Mashanov et al., 2012b).
Исследование регенерации перерезанного амбулакра, содержащего соединительную ткань гиподермы, радиальный нервный тяж, амбулакральный канал, а также мышцы, на 2, б, 12, 20 сут после повреждения у голотурии Н. glaberrima показало, что наибольшее количество транскриптов принадлежит генам, отвечающим за внеклеточный матрикс (со/, lama, integrin beta). Также обнаружены транскрипты генов, ответственных за сигнальные пути - survivin, туе, oct, bmp7, soxll и другие (Mashanov et al., 2014).
Сун и др. (Sun et al., 2013а) в исследованиях на A. japonicus разделяют гены, экспрессирующиеся при регенерации кишки, на две группы. Одни активны у неповрежденных животных, а при регенерации уровень их экспрессии значительно уменьшается и в дальнейшем постепенно приходит,., в норме. Эти гены необходимы животному для поддержания нормальных физиологических!процессов и, вероятно, в них1 нет особой необходимости при регенерации (pcsk, tag, loc, obg). Другая группа генов (his 1, he7, Idp, rap, tfp, hox6) наоборот имеет низкий уровень экспрессии у интактных животных, однако при регенерации количество их транскриптов резко возрастает. Более подробно исследована активность гена /юхб (Sun et al., 2013b). В норме экспрессия Иохб осуществляется на достаточно низком уровне. При регенерации количество транскриптов постепенно увеличивается и достигает максимума на 14 сут, после чего вновь уменьшается. В целом при регенерации у данног вида голотурий экспрессируется более 5 тысяч различных генов (Sun et al., 2011).
1.10. Роль Wnt в регенерации у иглокожих
Основные данные по разнообразию генов семейства Wnt у иглокожих были получены при анализе генома 5. purpuratus (Sodergreen, 2006). Было