Роль механо-геометрических факторов в пространственной организации осевых дифференцировок у зародышей шпорцевой лягушки

• Автор: Корникова, Евгения Сергеевна
• Шифр специальности: 03.03.05
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 102 с. : ил.

Оглавление
Введение

Обзор литературы

1. Карты презумптивных зачатков. Гаструляция

2. Молекулярные механизмы дифференцировки осевых зачатков при нормальном развитии зародышей Хепориэ (аеу/э,

2.1. Формирование дорсо-вентральной полярности зародыша Xenopus laevis.

2.2. Молекулярные механизмы образования центра Ныокупа и BNCE центра.

Мезодермальная индукция.

2.3. Формирование Шпемановского организатора. Нейральная индукция и модель двойного ингибирования.
2.4. Формирование нервной пластинки. Экспрессия у Xenopus ранних нейральных маркеров.
2.5. Генетические взаимодействия при формировании осевой мезодермы у Xenopus.
2.6. Формирование передне-задней полярности зародыша. Роль неканонического сигнального пути Wnt Planar Cell Polarity в формировании передне-задней оси.
2.7. Экспрессия маркера передних нейральных структур, гена 01x2, в раннем развитии зародышей Xenopus.
2.8. Роль молекул внеклеточного матрикса в регулягрш коллективных клеточных движений при гаструляции.
3. Роль механических напряжении в развитии
3.1. Методы оценки механического напряжения. Механические напряжения в раннем развитии амфибий.
3.2. Молекулярные механизмы механотрансдукции.
3.3. Мехапозависимая экспрессия генов.
Материалы и методы
Материалы
1.1. Реактивы
1.2. Ферментные препараты.
1.3. Лабораторное оборудование.
1.4. Лабораторные животные.
1.5. Буферы и растворы.
1.6. Микробиологические среды.
1.7. Предоставленные плазмиды.
2. Методы
2.1. Получение зародышей.
2.2. Микрохирургические операции и культивирование оперированных зародышей.
2.3. Тестирование механических напряжений.
2.4. Маркировка клеточных движений.
2.5. Фиксация эмбрионов.
2.6. Синтез гибридизационных зондов.
2.7. Процедура in situ гибридизации.
2.8. Гистологическая обработка.
2.9. Морфометрические измерения.
2.10. Статистические расчеты.
Результаты
1. Результаты ортотопной трансплантации СБО на стадии рапней-средией
гаструлы
1.1 . Изменение паттернов механических напряжений, вызванных ортотопной трансплантацией СБО.
1.2 . Морфология зародышей с ортотопно трансплантированной СБО.
1.3 . Перемещение ФДА-меченого материала СБО и вентральной области у оперированных зародышей.
1.4 . Паттерны экспрессии тканеспецифичных генов у зародышей с ортотопно трансплантированной СБО.
2. Результаты операций по искусственному изгибанию двойных эксплантатов

1.1. Наблюдение за развитием двойных эксплантатов СБО после изгибания.
1.2. Гистологическое исследование изменения форм клеток в двойных эксплантатах СБО в первые часы после изгиба.
1.3. Тестирование механических напряжений в изогнутых двойных
эксплантатах СБО.

1.4. Паттерны экспрессии тканеспецифичных генов в изогнутых двойных эксплантатах ОБО.
Обсуждение

1. Обсуждение результатов экспериментов по ортотопной трансплантации
1.1. Ортотопная трансплантация СБО приводила к релаксации напряжений в маргинальной зоне и перемещению основного узла натяжений с СБО на вентральную сторону.
1.2. Движения латеро-медиалыюй интерполяции клеток при гаструляции зависят от полей механических натяжений.
1.3. Для правильной закладки и ориентации осевых структур необходимы нормальные клеточные движения в период гаструляции.
2. Обсуждение результатов операций по искусственному изгибанию двойных эксплантатов СБО
2.1. Направление дифферепцировки клеток СБО по нейральному или мезодермалъному пути зависит от механо-геометрических условий в местах тс расположения.
2.2. Альтернативные интерпретации полученных результатов.
2.3. Принципиальное сходство механо-геометрических условий в изогнутых эксплантатах и у нормальных зародышей при пейруляции.
3. Структурные сходства экспериментальных образцов и зародышей других групп могут указывать на устойчивость формообразующих механизмов в эволюции.

Выводы

Благодарности

Список сокращений

Список литературы

США), парафиновая среда для гистологической заливки Histomix (БиоВитрум, Россия), о-ксилол (Химмед), смола Эпон 812 (Fluka, Швейцария), краситель гематоксилин Эрлиха, краситель толуидиновый синий, взвесь угольных частиц.
Набор для .выделения ДНК DNA Purification System (Promega, США).
1.2 Ферментные препараты.
В работе использовали SP6 и Т7 РНК-полимеразы для синтеза дигоксигенин-меченых РНК-зондов (Fermentas, Канада), Smal рестриктазу (Promega, США), дигоксигенин-специфичные антитела, связанные с щелочной фосфатазой anti-dig-AP-Fab fragment (Roche, Германия), флуоресцеин-специфичные антитела, связанные с щелочной фосфатазой anti-fluorescein-AP-Fab fragment (Roche, Германия), термостабильную Taq-ДНК-полимеразу из Thermus aquaticus (Fermentas, Канада), протеиназу К (Roche, Германия), ингибитор РНКаз RNasin (Promega, США).
1.3 Лабораторное оборудование.
В работе использовали настольную центрифугу Minispin plus (Eppcndorf, Германия), автоматический ПЦР-амплификатор MJ Mini (Bio-Rad, США), шейкер с термостатируемой камерой Environmental Shaker-Incubator ES-20 (BioSan, Россия), термостат (Binder, Германия), УФ-трансиллюминатор (Vilber Lourmat, Франция), весы аналитические «Adventurer» (Ohaus, Китай), автоматические микропинетки Labmate+ (HTL, Польша), микроинъектор Nanoject II (Drummond Scientific. Company, США), эпифлуоресцентный микроскоп Olympus SZX9 с флуоресцентным блоком U-RFL-T (Olympus Europe, Германия) фотокамера Olympus, фотокамера Canon, ультратом (Tesla, Чехия), микротом.
1.4 Лабораторные животные.
Для получения зародышей в работе использовали самцов и самок шпорцевых лягушек (Xenopus laevis Daudin).