Закономерности экспрессии нох-генов в процессе регенерации многощетинкового червя Alitta Virens (Polychaeta, Annelida)

• Автор: Новикова, Елена Львовна
• Шифр специальности: 03.03.05
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 149 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
1. ВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Явление регенерации и история её изучения

2.2. Типы регенерационных процессов

2.3. Регуляция регенерации

2.3.1. Позиционная информация и модели регенерации

2.3.2. Роль нервной системы в регенерации

2.3.3. Молекулярная регуляция репаративной регенерации

2.3.3.1. Группа Lophotrochozoa

2.3.3.2. Г руппа Ecdysozoa
2.3.3.3. Подтип Vertebrata, группа Deuterostomia
2.3.4. Нох-гены - регуляторный фундамент эмбриогенеза и регенерации
2.3.4.1. Нох-гены. Структурные и функциональные особенности
2.3.4.2. Эпигенетическая регуляция Нох-генов и механизм создания «позиционной памяти»
2.3.4.3. Роль Нох-генов в регенерации представителей разных ветвей Bilateria
2.3.4.3.1. Подтип Vertebrata, группа Deuterostomia
2.3.4.3.2. Группа Lophotrochozoa
2.3.5. Alitta virens. Жизненный цикл. Морфологическое строение
2.3.6. Разнообразие типов регенерации полихет
2.3.7. Ход регенерации полихет и клеточные источники
2.3.8. Стволовые клетки и клеточная миграция
2.3.9. Регенерация Alitta virens
2.3.10. Нох-гены в онтогенезе A. virens
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1. Протокол опыта по регенерации полихеты Alitta virens
3.2. Метод гибридизации in situ с применением РНК-зонда
3.3. Приготовление DlG-меченого РНК-зонда
3.3.1. Получение рекомбинантных клонов, содержащих фрагменты Нох-генов Alitta virens (Nereis virens) (Nvi-Hoxl, Nvi-IIox2, Nvi-НохЗ, Nvi-Hox4, Nvi-Hox5, Nvi-Lox5, Nvi-Hox7, Nvi-Lox4, Nvi-Lox2, Nvi-Post2)

3.3.2. Подготовка матрицы к синтезу
3.3.3. Синтез DIG3-MC4eHoro РНК-зонда
3.3.4. Оценка концентрации и размера полученного РНК-зонда
3.4. Протокол гибридизация in situ на тотальных препаратах (Whole mount in situ hybridization, WM1SH)
3.5. Анализ препаратов на уровне световой микроскопии
3.6. Обработка изображений
3.7. Адаптация метода WMISH для работы с регенерирующими червями Alitta virens
3.7.1. Обработка протеиназой К
3.7.2. Обработка коллагеназой
3.7.3. Ингибирование эндогенных фосфатаз
3.7.4. Использование SDS/Twecn-буфера
3.7.5. Особенности состава гибридизационного буфера
3.7.6. Постфиксация в 4% PFA после развития цветной реакции
3.8. Рабочие растворы и реагенты
4. РЕЗУЛЬТАТЫ
4.1. Экспрессия Nvi-Hoxl в регенерации Alitta virens
4.2. Экспрессия Nvi-Hox2 в регенерации Alitta virens
4.3. Экспрессия Nvi-НохЗ в регенерации Alitta virens
4.4. Экспрессия Nvi-Hox4 в регенерации Alitta virens
4.5. Экспрессия Nvi-Hox5 в регенерации Alitta virens
4.6. Экспрессия Nvi-Lox5 в регенерации Alitta virens
4.7. Экспрессия Nvi-Hox7 в регенерации Alitta virens
4.8. Экспрессия Nvi-Lox4 в регенерации Alitta virens
4.9. Экспрессия Nvi-Lox2 в регенерации Alitta virens
4.10. Экспрессия Nvi-Post2 в регенерации Alitta virens
4.11. Характер распределения Nvi-antiHox5 в регенерации Alitta virens
4.12. Характер распределения Nvi-antiHox7 в регенерации Alitta virens
5. ОБСУЖДЕНИЕ
5.1. Экспрессия Нох-генов в ходе регенерации Alitta virens
5.1.1. Гены раннего ответа
5.1.2. Гены среднего ответа, экспрессирующиеся в нервной системе
5.1.3. Гены среднего ответа, экспрессирующиеся в зоне роста
5.1.4. Гены позднего ответа
5.2. Двухфазная экспрессия Нох-генов в ходе регенерации A.virens
5.3. Закономерности пространственной и временной активности Нох-генов в ходе регенерации A.virens
5.4. Градиентная экспрессия Нох-генов задает позиционную информацию в теле A. virens
5.5. Сравнительная оценка регенерационных потенций и дефинитивной экспрессии Нох-генов у Bilateria
5.6. Вопросы регуляции
5.6.1. Антисмысловые транскрипты
5.6.2. Роль нервной системы в процессах регенерации A. virens
5.6.3. Регуляция регенерации через «организатор»
5.7. Униполярная регенерация Alitta virens - догадки и предположения
6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
7. ВЫВОДЫ
8. БЛАГОДАРНОСТИ
9. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
10 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

некодирующие транскрипты берут свое начало в PRE/TRE и это с большой вероятностью является причиной перехода PRE/TRE в активное состояние (Sanchez-Elsncr et al., 2006; Schmitt et al., 2005). Тканеспецифичный анализ показал, что одним из самых ранних событий в активации PRE/TRE может быть создание гибрида между ДНК PRE/TRE и некодирующей РНК, которая транскрибируется с этого участка. В результате происходит запуск ряда важных событий, таких как привлечение белка TrxG Ash 1 и активация сопряженного гена (Sanchez-Elsneret al., 2006).
Персистирующая на протяжении развития экспрессия некодирующих транскриптов через PRE/TRE подразумевает включение механизма длительного наследования этого явления. Было высказано предположение, что PcG-опосредованная репрессия происходит по умолчанию, а транскрипция через PRE/TRE этому противодействует и необходима после каждого клеточного деления для активации нужных PRE/TRE (Schmitt et al., 2005). В этом случае, те PRE/TRE, которые должны находиться в активном состоянии, должны нести метку активации на обоих нитях ДНК, чтобы быть распознанными и активированными после репликации. Такой меткой может служить, например, гистон НЗ.З, специфичные белки или особенности структуры ДНК (цит по Ringrose, Раго, 2007).
По некоторым данным, транскрипция нкРНК через промоторы Нох-генов напротив ведет к репрессии последних. Была предложена альтернативная модель «транскрипционной интерференции»: транскрипция 5’-локапизованных нкРНК через промоторы нижележащих генов, предотвращает экспрессию последних (Petruk et al., 2006).
Анализ фибробластов человека показал наличие 231 нкРНК в четырех Нох-локусах. Транскрипция как смысловых, так и антисмысловых последовательностей происходит в широких доменах, занятых РНК-полимеразой II, в то время как транскрипционно молчащие территории взаимодейевтуют с белком Suzl2, входящим в состав PRC2, а гистон НЗ в этих доменах триметнлирован по лизину 27 (Rinn et al., 2007). Было показано, что фибробласты с разной анатомической локализацией (например, легкое и нога) способны программировать НОХА локус на создание диаметрально противоположных картин экспрессии, но граница активного и неактивного хроматина в локусе при этом одна и та же (Рисунок 11) (Rinn et al, 2007).