Сравнение нормальных и опухолевых CD5-положительных B-клеток человека

• Автор: Поташникова, Дарья Марковна
• Шифр специальности: 03.03.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2015
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 117 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ
1.1 Актуальность проблемы
1.2 Цель и задачи исследования
1.3 Научная новизна и практическая значимость работы
1.4 Апробация работы
ГЛАВА 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1 В-лимфоциты в норме. Дифференцировка, созревание и иммунофенотип В-клеток
2.1.1 Дифференцировка В-клеток
2.1.2 Синтез иммуноглобулинов. Антиген-независимый этап созревания В-
клеток
2.1.3 Антиген-зависимоый этап созревания В-клеток
2.1.4 В-клеточный рецептор и сигнальный каскад от него
2.1.5 Иммунофенотип В-клеток
2.2 В-клеточные опухоли. Дифференциальная диагностика. Гетерогенность в
группе С05-положительных В-клеточных лимфом
2.2.1 Не-Ходжкинские лимфомы
2.2.2 Дифференциальная диагностика лимфом
2.2.3 Возможные предшественники CD5-положительных лимфом
2.3 Биология передачи сигнала в CD5-положительных лимфомах
2.3.1 Строение В-клеточного рецептора CD5-положительных лимфом
2.3.2 Строение BCR-каскада CD 5 - поп ожител ьных лимфом
2.4 Методические подходы к исследованию В-клеточных популяций
2.4.1 Клеточная сортировка чистых субпопуляций для анализа уровней
экспрессии генов
2.4.2 Подходы к исследованию В-клеток при помощи ПЦР в реальном времени.
Проблема нормализации данных при анализе уровней экспрессии мРНК
ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1 Пациенты и контроли
3.2 Гистология и иммуногистохимия
3.3 Проточная цитофлуориметрия

3.4 Клеточная сортировка
3.5 Получение РНК и кДНК
3.6 Подбор праймеров
3.7 ПЦР в реальном времени
3.8 Нормализация и статистический анализ
ГЛАВА 4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
4.1 Классификация исследованных в работе опухолевых тканей и реактивных контролей
4.2 Определение уровней экспрессии мРНК генов сигнальных белков BCR-
каскада в опухолевой и реактивной лимфоидной ткани
4.3 Описание CD5+CD19+ популяции неопухолевых лимфоцитов миндалин
4.4 Сортировка нормальных и опухолевых В-клеток. Определение уровней экспрессии мРНК генов сигнальных белков BCR-каскада в чистых субпопуляциях
4.5 Совместный анализ данных по экспрессии мРНК генов сигнальных белков BCR-каскада в отсортированных и неотсортированных лимфоидных образцах
4.6 Анализ экспрессии ZAP-70 в CD5+CD19+ В-клетках миндалин методом
проточной цитофлуориметрии
ГЛАВА 5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
5.1 Опухолевые В-клетки В-ХЛЛ и ЛКМЗ имеют уникальный профиль экспрессии сигнальных белков
5.2 Клетки лимфом из «серой зоны» между В-ХЛЛ и ЛКМЗ отличаются как по экспрессии поверхностных антигенов, так и по уровням экспрессии сигнальных компонентов BCR-каскада
5.3 Характеристика СD5-положитсяьных клеток миндалин
5.4 Уровни экспрессии генов сигнальных молекул BCR-каскада в норме и при
патологии
ГЛАВА 6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЯ
ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ
1.1 Актуальность проблемы
В-клетки - потомки общего лимфоидного предшественника, прошедшего в процессе дифференцировки и созревания ряд стадий с последовательной сменой поверхностного иммунофенотипа, эпигенетического и транскрипционного профилей. Основополагающую роль в выживании и дифференцировке В-лимфоцита играет сигнал фосфорилирования, получаемый через В-клеточный рецептор (BCR): митогенные и антиапоптотические сигналы передаются в ядро через BCR и ко-рецепторные комплексы. В зависимости от привлеченных ко-рецепторов сигнал может изменяться и приводить к разным последствиям для В-клетки. Помимо специфического комплекса BCR на поверхности В-клетки находится большой набор различных молекул, являющихся рецепторами, ко-рецепторами, лигандами, транспортерами или молекулами адгезии. Вместе они обеспечивают активацию В-клеток, их миграцию в организме по сложньм траекториям и, в конечном счете, выполнение их функции в составе иммунной системы.
Набор поверхностных молекул на мембране В-лимфоцита позволяет дать развернутую характеристику его происхождения и функционального состояния. Значительный объем информации о структуре, функциях и паттернах экспрессии поверхностных антигенов, накопленный на сегодняшний день, позволяет описывать многообразие В-клеточных субпопуляций в норме, а также при патологических состояниях. Так, диагностика В-клеточных лимфом базируется на развернутом описании поверхностных антигенов. Однако поиск сходств и различий между нозологическими группами зачастую ограничивается анализом поверхностных маркеров и мутационного статуса В-клеточного рецептора, и не касается экспрессии проводящих элементов сигнального BCR-каскада, расположенных в цитоплазме.
Передача сигнала от зрелого BCR обеспечивается BCR-ассоциированными тирозинкиназами и тирозинфосфатазами (SYK, LYN, SHP-1, ZAP-70), которые активируют универсальные сигнальные молекулы - PI3K, PLC, РКВ и РКС (DeFranco, 1997; Geisberger et al., 2003; Harwood, Batista, 2010). Эффекторными молекулами BCR-каскада являются транскрипционные факторы, обеспечивающие размножение и выживание клеток. Так как важнейшие характерные свойства опухолевых клеток обусловлены аномальным функционированием сигнальных путей, контролирующих клеточный цикл и апоптоз (Hanahan, Weinberg, 2000; Hanahan, Weinberg, 2011), актуальным представляется изучение экспрессии сигнальных белков BCR-каскада в различных В-клеточных лимфомах.

Ряд исследований свидетельствует о том, что нормализация по любому единственному референтному гену недостаточна для человеческих тканей (Bas et al., 2004; Tricarico et al., 2002). Таким образом, альтернативный подход к нормализации данных основывается на определении уровней представленности набора из сразу нескольких мРНК генов «домашнего хозяйства». Фактор нормализации для одного образца таким образом вычисляется как среднее значение экспрессии нескольких стабильно экспрессируемых в пробе генов и используется как делитель для уровня экспрессии мРНК исследуемого гена. Математические алгоритмы выбора наиболее стабильно экспрессируемых генов различались у разных авторов (Vandesompele et al., 2002; Pfaffl et al., 2004; Andersen et al., 2004), но, в конечном счете, давали схожие результаты.
Стратегия с выбором наиболее надежных референтных генов для проведения эксперимента сильно удлиняет этап получения предварительных данных, однако, несмотря на это, подобные работы постепенно становятся стандартом для ПЦР-исследований и уже были аккуратно проведены для многих опухолевых и неопухолевых тканей (Kheirelseid et al., 2010; Sorby et al., 2010; Ledderose et al., 2011; Gorzelniak et al., 2001; Ferguson et al., 2010), в частности для лимфом человека (Green et al., 2009; Valceckiene et al., 2010). В результате сильно возрастает чувствительность метода ПЦР в реальном времени: для группы В-зрелоклеточных лимфом с помощью правильно подобранных референтных генов были показаны достоверные различия в экспрессии гена циклина D1 между разными нозологиями (Gladkikh et al., 2010).
Таким образом, использование новейших подходов к анализу субпопуляций опухолевых и нормальных клеток человека позволяет проводить их более глубокое сравнение на фенотипическом и генетическом уровне. Совмещение сортировки чистых субпопуляций лимфоцитов с улучшенной стратегией ПЦР-анализа является перспективным подходом к исследованию CDS-положительных В-клеток в норме и при патологии.