Цитологическая характеристика эпителиальной клеточной культуры MDCK (Madine-Darby Canine kidney cells) с использованием новых биосенсоров

• Автор: Болаева, Кермен Валериевна
• Шифр специальности: 03.03.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Астрахань
• Количество страниц: 277 с. : ил.

Содержание работы

Введение

Глава I. Обзор литературы

1.1. Биологическая характеристика клеточной культуры MDCK и ее трапсфектантов

1.2. Биосенсоры, их применение в сочетании с методами микроскопии для цитологической характеристики живых клеточных культур
1.3. Процессы, вызывающие перестройку цитоскелета эпителиальных клеток и привлечение биосснсоров для их описания

1.4.1. Изменения цитоскелета под воздействием гепатоцитного ростового фактора

1.4.2. Перспективы исследования процесса апоптоза при помощи биосенсоров

1.5. Использование молекулярного биосенсора SNARF-1 для измерения цитоплазматического pH в живых клеточных культурах как метод изучения активности карбоксиангидразы-
1.6. Биологическое значение механического стресса для клеточных культур и его влияние на биохимические процессы

1.7. Заключение

Глава II. Материалы и методы
11.1. Культивация эпителиальной клеточной культуры MDCK. и ее трансфекгантов в условиях клеточного инкубатора
11.2. Культивация эпителиального клеточной культуры MDCK в условиях проточной биосенсорной системы
11.3. Метод оптической и флуоресцентной микроскопии
11.4. Инициирование апоптоза в клетках MDCK при помощи блеомицина
11.5. Стимулирование клеток MDCK при помощи гепатоцитного ростового фактора
11.6. Использование молекулярного сенсора SNARF-1 для определения цитоплазматического pH
Приложение
Глава III. Цитологическая характеристика эпителиальной клеточной культуры MDCK (Madine-Darby Canine kidney cells) с использованием

проточной биосенсорной системы на основе кварцевого пьезо-кристалла и с привлечением молекулярного биосснсора SNARF-
III. 1. Характеристика процессов адгезии и пролиферации клеточной культуры MDCK-1I а поверхности кварцевого кристалла Приложение
111.2. Характеристика процесса апопгоза в клеточной культуре MDCK Приложение
111.3. Характеристика изменений в клеточной культуре MDCK под воздействием гепатоцитного ростового фактора
Приложение
111.4. Механический стресс как фактор влияющий на изменения свойств клеточной культуры MDCK
Приложение
111.5. Влияние белка карбоксиангидразы 9 на изменение свойств трансфектантов клеточной культуры MDCK. в условиях нормального и пониженного содержания кислорода. Ингибирование белка карбоксиангидраза-9 как фактор, влияющий на изменение свойств трансфектантов клеточной культуры MDCK Приложение б
Заключение
Выводы
Научно-практические рекомендации Список сокращений Список литературы

ВВЕДЕНИЕ
Эпителиальная клеточная культура MDCK (Madine-Darby Canine kidney cells) широко используется различными исследователями в качестве модельной системы эпителиальных тканей (Горшков, 2009; Madine and Darby, 1965; Ridley et al., 1995). Эпителиальная ткань, выполняя множество функций в организме, является удачной моделью исследования для межклеточных взаимодействий. Животные клетки в пределах одного эпителиального монослоя активно взаимодействуют друг с другом и другими тканями, и изучение данных взаимодействий представляет собой интересную задачу. Термин «межклеточные взаимодействия» может относиться к любому случаю, когда клетка или группа клеток испытывает влияние со стороны других клеток, находящихся поблизости. Например, реакцию эмбриональных клеток па присутствие других клеток можно заметить сразу, наблюдая под микроскопом живые клетки в культуре. Так, клетки ранних зародышей амфибий па всей поверхности образуют псевдоподии, пытаясь прилипнуть к другим клеткам. Другим примером является «контактное торможение» - процесс, во время которого фибробласты - вытянутые веретеновидпые клетки, встречающиеся в соединительной ткани, теряют свою подвижность после соединения с другой клеткой (Abercrombie and Heysman, 1954). В отличие от них клетки нервного гребня, из которых образуются нервные ганглии и меланофоры, отталкиваются от друг от друга; если такую клетку поместить в культуру, и она будет оставаться в одиночестве, она не будет передвигаться, если же к ней добавить аналогичную клетку, клетки начинают двигаться в противоположные стороны (Twitty and Niu, 1948). Ясно, что взаимодействие друг с другом клетки осуществляют как при помощи непосредственного контакта с соседними клетками посредством межклеточных контактов, гак и при помощи сигнальных протеинов - интерлейкинов. Другими сигналами клетке о присутствии и состоянии клеток по соседству являются продукты

Данные, полученные от пьезо-кристалла обрабатываются при помощи электро-импеданс спектроскопии, определяются такие параметры электрического контура как Со, Rs, Ls, Cs. В результате, на компьютер считываются и сохраняются следующие данные - спектр сигнала резонансной частоты кварцевого кристалла па каждый момент времени и кондуктивный максимум (Jacobs et al., 2007, 2008. 2009; Cama et al 2008, 2009).
В настоящей работе для культивации клеточной культуры MDCK-II используется микрокапиллярная биосенсорная система на основе кварцевого пьезо-кристалла. Даная система была разработана и апробирована с целыо использования ее для альтернативного способа изучения клеточных культурДасоЬз et al., 2008, 2009; Cama et al., 2009).
Кроме такой важной составляющей биоректора как сенсор, при анализе процессов, происходящих в клетках, большое количество данных может быть собрано при помощи микроскопии. Наблюдение за живыми клетками при обычном свете используется наравне с флуоресцентными снимками для обеспечения информацией о форме клетки, ее расположении и движении. Это крайне важно при изучении процесса митоза во время которого форма клеток подвергаются сильным изменениям. Быстрое развитие микроскопии живых клеток требует разработки новых флуоресцентных молекулярных систем, которые могут быть использованы для изучения различных новых белков, а также требует разработки новых типов микроскопов и программного обеспечения к ним. Большой интерес представляет разработка методов автоматизации при наблюдении внутриклеточной локализации и передвижении клеток. Данный процесс происходит с параллельной разработкой биосенсорных систем совмещенных с флуоресцентной микроскопией, которая предоставляет собой оптическое представление физиологических эффектов, коорые часто основаны на использовании технологии зеленой флуоресценции (GFP) или биолюминисценции. В то