Выявление и характеристика ориджинов репликации центра инактивации X-хромосомы полевки Microtus levis

• Автор: Шерстюк, Владимир Владимирович
• Шифр специальности: 03.03.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2015
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 137 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

Список использованных сокращений

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Ориджины репликации эукариот

1.1.1. Процесс инициации репликации на ориджине

1.1.2. Последовательности ДНК в районах ориджинов репликации

1.1.3. Методы картирования ориджинов репликации в геномах эукариот

1.1.3.1. Метод иммунопреципитации хроматина

1.1.3.2. Метод двумерного гель-электрофореза

1.1.3.3. Анализ коротких новосинтезированных нитей ДНК
1.1.3.4. ВиЬЫе-Фар метод
1.1.3.5. Картирование точек старта репликации на уровне отдельных нуклеотидов
1.1.3.6. Метод молекулярного комбинга
1.1.4. Эффективность ориджинов репликации
1.1.5. Локализация ориджинов репликации в промоторах генов и их регуляция
1.1.5.1. Участие комплексов ремоделинга хроматина в регуляции ориджинов репликации
1.1.5.2 Участие факторов транскрипции в регуляции ориджинов репликации
1.1.6. Механизмы регуляции ориджинов репликации, расположенных в районах гетерохроматина
1.1.7. Модификации гистонов в районах ориджинов репликации
1.1.7.1. Ацетилирование гистонов стимулирует активность ориджинов
1.1.7.2. Метилирование Н4К20 участвует в регуляции лицензирования ориджинов репликации
1.1.8. Влияние Срв островков и уровня их метилирования на активность ориджинов репликации
1.1.9. Пространственная организация репликации в ядре. Фокусы репликации
1.1.10 Ассоциация ориджинов репликации с ядерным матриксом
1.1.11. Регуляция ориджинов репликации в процессе эмбрионального развития и дифференцировки клеток
1.1.12. Регуляция временной картины репликации генома. Репликационные домены
1.2. Центр инактивации Х-хромосомы
1.2.1. Структура центра инактивации Х-хромосомы мыши и полевки
1.2.2. Ориджины репликации центра инактивации Х-хромосомы мыши
1.2.3. Модификации хроматина в центре инактивации Х-хромосомы мыши
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Материалы

2.1.1. Культуральные среды, сыворотки, антибиотики, добавки
2.1.2. Ферменты
2.1.3. Реактивы
2.1.4. Растворы и буферы
2.1.5. Наборы
2.2. Объект исследования
2.3. Методы
2.3.1. Методы работы с клеточными культурами
2.3.1.1. Состав культуральных сред и условия культивирования
2.3.1.2. Замораживание клеток
2.3.1.3. Размораживание клеток
2.3.2. Получение нсДНК из асинхронно делящейся культуры клеток
2.3.3. Иммунофлуоресцентное окрашивание ядер клеток
2.3.4. Электрофорез белков в полиакриламидном геле
2.3.5. Вестерн блот-гибридизация
2.3.6. Иммунопреципитация хроматина (ChIP)
2.3.7. Выделение РНК
2.3.8. Синтез кДНК методом обратной транскрипции
2.3.9. Подбор праймерных пар
2.3.10. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
2.3.11. ПЦР в реальном времени
2.3.12. Электрофорез ДНК в агарозном геле
2.3.13. Выделение фрагментов ДНК из гелей
2.3.14. Определение нуклеотидной последовательности ДНК
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Картирование ориджинов репликации в центре инактивации Х-хромосомы самцов полевки М. levis
3.1.1. Картирование активных ориджинов репликации методом NSAA в ТС клетках, клетках XEN и фибробластах самцов полевки М. levis
3.1.2. Локализация сайтов связывания ORC в локусе XIC в фибробластах самцов М. levis
3.2. Анализ нуклеотидного состава ориджинов репликации в локусе Х1С
М. levis
3.3. Анализ ассоциации ориджинов репликации с G4 мотивами
3.4. Статус экспрессии генов в локусе XIC в фибробластах самцов М. levis
3.5. Распределение гистона НЗ и его варианта НЗ.З в локусе XIC М. levis
3.6. Модификации хроматина в локусе XIC в фибробластах самцов М. levis. Паттерн ацетилирования НЗК9, монометилирования Н4К20 и триметилирования НЗК27
3.7. Сравнение расположения ориджинов репликации в локусах Х1С
М. musculus и М. levis

ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

другой стороны, привлечение PR-SET7 в локус, который не содержит ориджин репликации, индуцирует сборку pre-RC. Накопление недеградируемой мутантной формы PR-SET7 в S фазе приводит к ререпликации ДНК. Механизм, по которому данная модификация участвует в лицензировании ориджинов, еще неокончательно изучен. Существуют свидетельства, что действие H4K20mel может быть опосредованным. Известно, что гистонметилтрансферазы SUV4-20H1 и SUV4-20Н2, которые осуществляют ди- и триметилирование Н4К20, используют H4K20mel в качестве субстрата (Beck et al., 2012; Schotta et al., 2008). Показано, что белок ORCA, который, как предполагается, участвует в связывании ORC с ДНК, взаимодействует с H4K20me3 (Shen et al., 2010; Vermeulen et al., 2010). Интересно, что привлечение PR-SET7 приводит к повышению Н4К20теЗ в данном локусе (Beck et al., 2012). С другой стороны, при уменьшении уровня Н4К20теЗ показано отсутствие связывания белков ORCA и ORC1. Также было показано, что ORC1 связывается с Н4К20те2 через ВАН домен. Важную роль ди- и триметилирования Н4К20 в регуляции ориджинов репликации подтверждает тот факт, что при отсутствии данных модификаций у эмбрионов Danio rerio наблюдается фенотип, аналогичный наблюдаемому у человека при мутации в ВАН домене ORC1 или при нарушении экспрессии ORC1, также известный как синдром Мейера-Горлина (Kuo et al., 2012).
Некоторые исследователи считают, что метилирование Н4К20 может влиять на уровень ацетилирования гистона Н4, уменьшая его и , тем самым, нарушая сборку pre-RC (Iizuka et al., 2006; Miotto, Struhl, 2010; Nishioka et al., 2002). С другой стороны, показано, что ацетилирование по шестнадцатому лизину гистона Н4 преимущественно осуществляется на Н4К20 диметилированных гистонах (Pesavento et al., 2008).
Таким образом, PR-SET7 может регулировать связывание ORC с ДНК через метилирование Н4К20. Однако механизмы данной регуляции, как и влияние различных степеней метилирования Н4К20 на процесс инициации репликации, требуют дальнейшего изучения.