Молекулярно-клеточная оценка рекомбинантных белков VP24 в механизмах вирулентности вируса Эбола

• Автор: Шелемба, Арсения Александровна
• Шифр специальности: 03.03.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 120 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Глава 1. ВИРУС ЭБОЛА, ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

1.1. Эпидемиологическая характеристика лихорадки Эбола

1.2. Патогенность вируса Эбола для видов животных

и адаптация дикого штамма вируса к новому хозяину

1.3. Клиническая характеристика лихорадки Эбола

1.4. Патогенез лихорадки Эбола

1.5. Структура генома и функции компонентов репликативного комплекса вируса Эбола

1.6. Структура и функции вирусных белков

1.7. Исследование функций вирусных белков на модели Drosophila melanogaster
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Глава 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Общая характеристика экспериментальных животных, плазмид и рекомбинантных белков
2.2. Метод выделения мононуклеарных клеток и оценка стимулированного синтеза иммуноглобулинов
2.3. Метод выделения плюрипотентных клеток костного мозга и оценка стимулирующей гемопоэз активности рекомбинантных белков
2.4. Метод определения числа коммитированных гемопоэтических предшественников
2.5. Метод оценки индукции интерферона в системе in vivo..
2.6. Метод оценки индукции интерферона в системе in vitro.
2.7. Метод трансформации Drosophila melanogaster
2.8. Методы статистического анализа
Глава 3. ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ VP24 ВИРУСА ЭБОЛА НА ГУМОРАЛЬНЫЙ ОТВЕТ МОНОНУКЛЕАРНЫХ КЛЕТОК МОРСКИХ СВИНОК
3.1. Исследование спонтанного уровея синтеза глобулинов, стимулируемого бычьим сывороточным альбумином в культуре мононуклеарных клеток
3.2. Построение калибровочных кривых для суммарных иммуноглобулинов и для IgG
3.3. Исследование уровня синтеза суммарных

иммуноглобулинов и IgG в культуре МНК
3.4. Резюме
Глава 4. ВЛИЯНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ ВАРИАНТОВ БЕЛКА VP24 ВИРУСА ЭБОЛА НА КОЛОНИЕОБРАЗОВАНИЕ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИМИ ПРЕДШЕСТВЕННИКАМИ У МЫШЕЙ
4.1. Оценка влияния рекомбинантных белков вируса Эбола
на рост эритроидных предшественников у мышей
4.2. Оценка влияния рекомбинантных белков вируса Эбола на рост гранулоцитарно-макрофагальных
предшественников у мышей
4.3. Резюме
Глава 5. ВЛИЯНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ ВАРИАНТОВ БЕЛКА VP
ВИРУСА ЭБОЛА НА ИНДУКЦИЮ ИНТЕРФЕРОНА
5.1. Исследование содержания противовирусных интерферонов
в сыворотке in vivo
5.2. Исследование содержания противовирусных интерферонов
в системе in vitro
5.3. Резюме
Глава 6. ИЗУЧЕНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ РОЛИ МУТАЦИОННОЙ ЗАМЕНЫ В ГЕНОМЕ АДАПТИРОВАННОГО К МОРСКИМ СВИНКАМ ВИРУСА ЭБОЛА НА МОДЕЛИ
DROSOPHILA MELANOGASTER
6.1. Получение трансгенных линий Drosophila melanogaster с применением техники трансформации дрозофилы
6.2. Экспрессия ур24-д и ур24-8мс в дорзальной области
почки крылового имагинального диска
6.3. Экспрессия ур24-д и ур24-8мс в соматических тканях Drosophila melanogaster
6.4. Резюме
Глава 7. МОЛЕКУЛЯРНО-КЛЕТОЧНЫЕ МОДИФИКАЦИИ МЕХАНИЗМОВ ВИРУЛЕНТНОСТИ ВИРУСА ЭБОЛА ПРИ ВВЕДЕНИИ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ VP24 IN VIVO И IN VITRO (ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ)
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Список использованных сокращений
8мс - лабораторный штамм вируса Эбола адаптированный к морским свинкам.
AJTT - аланинаминотрансфераза ACT - аспартатаминотрансфераза БОЕ - бляшкообразующая единица ВВС - вирус везикулярного стоматита ВМ - вирус Марбург ВОВ - вирус осповакцины -ВГТЧ - вирусоподобные частицы ВЭ - вирус Эбола
ГМ-КСФ - гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор
ГНЦВБ «Вектор» - государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор».
ДВС - синдром диссеменированного внутрисосудистого свертывания.
ИЕ - интерфероновые еденицы ИЛ (IL) - интерлейкин ИФН - интерферон
К5 - лабораторный штамм вируса Эбола адаптированный к морским свинкам.
ЛПС (LPS) - липополисахарид ЛЭ - лихорадка Эбола.
МА - лабораторный штамм вируса Эбола адаптированный к мышам.
МГМ - межфазный гидрофобный момент МКА(Т) - моноклональные антитела МНК - мононуклеарные клетки ОП - оптическая плотность
РНП-комплекс - рибонуклеопротеиновый комплекс.
СМФ - система мононуклеарных фагоцитов ТЭМ - трансмиссионная электронная микроскопия
ФИО (TNF) - фактор некроза опухолиРЭС - ретикулоэндотелиальная система
ЦПД - цитопатогенное действие

по длине участки GP возбудителей видов Рестон и Заир.
Для обоих типов МКАТ установлена специфичность к ВЭ вида Заир и подтверждена протективная эффективность на мышах при заражении адаптированным к мышам штаммом ВЭ. Показано, что 133/3.16 и 226/8.1 МКАТ распознавали аминокислотные остатки GP ВЭ Заир, соответственно в положении 521-560 и 1-232. Для дальнейших экспериментов был получен химерный вирус ВВС-GP, у которого ген G ВВС заменен на ген GP ВЭ (вида Заир).
Выращивание химерных вирусов в присутствии МКАТ и отбор мутантных вариантов проводили на клетках 293. Данные секвенирования генома этих мутантов показали, что все они содержали единственную аминокислотную замену в GP. Три мутантных варианта, отобранные в присутствии 133/3.16 МКАТ, содержали аминокислотную замену в положении 549 His—* Arg в ОР2-субъединице вблизи фьюжен участка домена. В присутствии 226/8.1 МКАТ были отобраны 3 мутантных варианта с аминокислотными заменами Leu—>Ser, Phe—>Ser и Arg—»Gin, соответственно в положениях 199, 194 и 134 GP1 субъединицы. Отсюда сделан вывод, что этот тип МКАТ связывается с конформационным эпитопом.
Таким образом, с учетом идентифицированных ранее трех эпитопов в молекуле GP картировано 5 вируснейтрализующих эпитопов. Интересно, что неструктурный секретируемый белок sGP не реагировал с 226/8.1 МКАТ, хотя GP и sGP имеют идентичные N-концевые последовательности (295 аминокислотных остатков) и несколько общих вируснейтрализующих эпитопов. Представляется возможным, что различные формы олигомеризации этих двух белков влияют на структуру этого конформационного эпитопа или его доступность для антител.
Важно отметить, что, по данным клинических наблюдении, в крови больных ЛЭ в острой стадии заболевания выявляются значительные концентрации белка sGP, молекулы которого могут функционировать в качестве ловушки для нейтрализующих антител [Dolnik О. et al., 2004]. В связи с этим нейтрализующие антитела, которые не реагируют с sGP, представляют значительный интерес для разработки средств иммунотерапии.
Химерные вирусы обладали значительной скоростью репликации, сравнимой с таковой аутентичного ВВС: в культуре клеток Vero Е6 через 2 -3 сут титр вируса достигал 107 БОЕ/мл. Поэтому использование предложен-