Получение постоянных линий эмбриональных стволовых клеток человека и сравнение их характеристик при культивировании в разных системах

• Автор: Кольцова, Анна Михайловна
• Шифр специальности: 03.03.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 144 с. : ил.

ГЗ ъ(8
ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Эмбриональные стволовые клетки человека

1.1.1. Общая характеристика эмбриональных стволовых клеток

1.1.2. Получение и культивирование линий ЭСК человека

1.1.2.1. Выделение внутренней клеточной массы бластоцисты

1.1.2.2. Культивирование ЭСК человека

1.1.2.2.1. Фидерная система культивирования ЭСК человека
1.1.2.2.2. Бесфидерная система культивирования ЭСК человека
1.1.2.2.3. Ростовая среда для культивирования ЭСК человека
1.1.3. Основные маркеры, определяющие статус ЭСК человека
1.1.4. Маркеры диффсренцировки ЭСК человека in vitro и in vivo
1.1.5. Определение кариотипа ЭСК человека
1.1.6. Межлинейные различия ЭСК человека
1.1.7. Перспективы использования ЭСК человека для прикладных биомедицинских исследований
1.1.7.1. Препятствия для использования ЭСК в регенеративной медицине
1.1.7.2. Примеры использования ЭСК человека в регенеративной медицине
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Выделение внутренней клеточной массы из предимплантационных бластоцист
2.2. Культивирование и митотическая инактивация фидерных клеток
2.3. Культивирование ЭСК человека в условиях фидерного слоя
2.4. Определение времени удвоения популяции ЭСК человека
2.5. Кариотипирование
2.6. Дифференцировка ЭСК in vitro
2.7. Гистохимический анализ активности щелочной фосфатазы
2.8. Иммунофлуоресцентный анализ экспрессии маркеров недифференцированных и дифференцированных ЭСК человека

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Эмбриональные стволовые клетки человека
1.1.1. Общая характеристика эмбриональных стволовых клеток
1.1.2. Получение и культивирование линий ЭСК человека
1.1.2.1. Выделение внутренней клеточной массы бластоцисты
1.1.2.2. Культивирование ЭСК человека
1.1.2.2.1. Фидерная система культивирования ЭСК человека
1.1.2.2.2. Бесфидерпая система культивирования ЭСК человека
1.1.2.2.3. Ростовая среда для культивирования ЭСК человека
1.1.3. Основные маркеры, определяющие статус ЭСК человека
1.1.4. Маркеры дифференцировки ЭСК человека in vitro и in vivo
1.1.5. Определение кариотипа ЭСК человека
1.1.6. Межлинейиые различия ЭСК человека
1.1.7. Перспективы использования ЭСК человека для прикладных биомедицинских исследований
1.1.7.1. Препятствия для использования ЭСК в регенеративной медицине
1.1.7.2. Примеры использования ЭСК человека в регенеративной медицине
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Выделение внутренней клеточной массы из преднмплантационных бласгоцист
2.2. Культивирование и митотическая инактивация фидерных клеток
2.3. Культивирование ЭСК человека в условиях фидерного слоя
2.4. Определение времени удвоения популяции ЭСК человека
2.5. Кариотипирование
2.6. Дифферепцировка ЭСК in vitro
2.7. Гистохимический анализ активности щелочной фосфатазы
2.8. Иммунофлуоресцентный анализ экспрессии маркеров недифференцированных и дифференцированных ЭСК человека
2.9. Дифференцировка ЭСК in vivo
2.10. Анализ экспрессии генов методом ПЦР
2.11. Получение и характеристика линии мезенхимных стволовых клеток SC5-MSC
2.12. Получение кондиционированной среды от клеток линии SC5-MSC
2.13. Получение внеклеточного матрикса от клеток линии SC5-MSC
2.14. Иммунофлуоресцентный анализ белков ВКМ
2.15. Оценка уровня флуоресценции белков ВКМ
2.16. Электрофоретический анализ состава ВКМ
2.17. Иммунобло пинг
2.18. Культивирование ЭСК в бесфидерной системе
2.19. Анализ поверхностных маркеров плюриполентных ЭСК методом проточной цитофлуориметрии
2.20. Статистическая обработка результатов
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Получение и характеристики линий ЭСК в условиях фидерного культивирования
3.1.1. Выделение внутренней клеточной массы из предимплантационных бластоцист
3.1.2. Кариотипичсский анализ линий SC5, SC6 и SC7
3.1.3. Анализ маркеров недифференцированных ЭСК человека в линиях SC5, SC6 и SC7
3.1.4. Дифференцировка ЭСК линий SC5, SC6 и SC7 in vitro
3.1.5. Дифференцировка ЭСК линий SC5, SC6 и SC7 in vivo
3.1.6. Анализ экспрессии генов плюриполентных ЭСК и генов ранней дифферепцировки методом Г1ЦР в линиях SC5, SC6 и SC7
3.2. Анализ экспрессии транспортера множественной лекарственной устойчивости в линиях SC5, SC6 и SC7
3.3. Влияние условий кульливирования на проявление свойств линий ЭСК
3.4. Характеристика клеточной линии SC5-MSC, полученной из линии
ЭСК SC5
3.5. Разработка бесфидерной системы кульливирования ЭСК человека
гликопротеин, входящий в CD-34-семейство сиаломуцинов (Kerjaschki et al., 1986; Kershaw et al., 1997; Sassetti et al., 2000). Впоследствии он был показан для человеческих гематопоэтичеекпх клеток, как компонент специфического взаимодействия с рецептором клеточной адгезии эндотелиальных клеток - 1-сслектином (Sassetti et al., 1998; Нага et al., 1999). Подоксалин является тестикулярным опухолевым маркером для человеческих линий эмбриональной карциномы (Schopperle et al., 2003). Его экспрессия также показана и на линиях эмбриональных стволовых клеток (Thomson et al., 1998; Richards et al., 2003; Bhattacharya et al., 2004).
Для плюрипотентных стволовых клеток характерна экспрессия щелочной фосфатазы. Тканевая неспецифическая щелочная фосфатаза - связанный с мембраной гликопротеимовый энзим, способный к гидролизу органических фосфатаз в щелочной среде (Harris, 1989). Эго высококопссрватмвный энзим. Тканевая неспецнфическая щелочная фосфатаза у всех млекопитающих имеет схожую биологическую активность и распространена фактически во всех тканях млекопитающих, особенно во время эмбрионального развития (McComb et al. 1979). Этот энзим играет роль в процессе формирования тканей при эмбриональном развитии, а также ассоциирован с клеточной дпффереицировкой (Owen et al. 1990; Andracchi and Körte 1991; Feldbush and Lafrcnz 1991) и пролиферацией (Fedarko et al. 1990). Для ЭСК человека активность щелочной фосфатазы является необходимым маркером, который может быть использован при рутинной работе для быстрого выявления колоний недифференцированных клеток. Окраска на щелочную фосфатазу по сравнению с иммунофлуоресцеитной окраской антителами - быстрый и дешевый метод (O’Connor et al., 2008). При индукции дифференцировки, активность щелочной фосфатазы, как и других маркеров недифференцированных клеток, стремительно снижается (Ilenderson et al., 2002).
Экспрессия генов Dppa3 (также известный как Stella или Pgc7) и Dazl необходимы для подтверждения потенциальной дифференцировки ЭСК в линию половых клеток.
Ген ОрраЗ специфически экспрессируется в примордиальных половых клетках, ооцптах, предимплантацпонных эмбрионах и плюрипотентных клетках. Опыты на мышах показали, что отсутствие этого гена приводит к несостоятельности эмбриона