Токсический эффект синергичного воздействия цитостатика циклофосфана и экзогенной ДНК

• Автор: Долгова, Евгения Владимировна
• Шифр специальности: 03.03.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 191 с. : ил.

Автор выражает большую благодарность:

B.П. Николину и H.A. Поповой (ИЦиГ СО РАН) за помощь в работе с экспериментальными животными,
Н.В. Воробьевой и Н.А. Сердюковой (ИХБФМ СО РАН) за помощь при проведениях FISH и PRNS анализов,
О.И. Лаврик (ИХБФМ СО РАН) за проведение консультации по вопросам механизмов репарации, описываемых в литературном обзоре настоящей работы,

Я.Р. Ефремову (ИЦиГ СО РАН) за помощь в работе с проточным цитофлуориметром,

C.И. Байбородину за помощь в работе с конфокальным сканирующим лазерным микроскопом,
О.С. Таранову и Е.М. Майковой (ГНЦ ВБ «Вектор») за помощь в проведении патологоанатомического анализа тканей и органов экспериментальных животных,

А.Г. Шилову (ИЦиГ СО РАН) за помощь в работе с культурами клеток,

С.С. Богачеву, A.C. Проскуриной, Е.А. Алямкиной, К.Е. Орищенко, A.B. Прокопенко, В.А. Рогачеву (ИЦиГ СО РАН) за помощь в планировании и осуществлении экспериментов.
ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Горизонтальный перенос генетической информации
1.2. Естественные источники экстраклеточной ДНК в организме
1.3. Механизмы проникновения фрагментов экзогенной ДНК в компартменты эукариотической клетки
1.4. Рекомбиногенная ситуация в соматической клетке. Основные характеристики
1.5. Активация систем контроля клеточного цикла. Индукция репаративного процесса
1.5.1. Активация системы иерархических киназ
1.5.2. Активация эффекгорных киназ. Остановка клеточного цикла
1.6. Организация концов ДЦР хромосомы. Основные пути репарации
1.7. Пути утилизации фрагментов экзогенной ДНК, доставленных в клеточные компартменты
1.7.1. Репарация по механизму ГР. Интеграция фрагментов экзогенной
ДНК с использованием механизма ГР
1.7.2. Негомологичное объединение концов молекулы ДНК. Захват фрагментов ДНК
1.8. Экстраклеточная ДНК и ее взаимоотношения с системой остановки клеточного цикла
1.9. Цитостатические препараты. Механизм формирования МЦС. ДЦР, индуцированные кросслинкирующими цитостатиками
1.10. Основные молекулярные механизмы репарации МЦС
1.10.1. Экспериментально обоснованные схемы репарации МЦС у млекопитающих, описанные в мировой литературе
Заключение
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Разведение экспериментальных животных
2.2. Препарат ДНК человека
2.3. Введение мышам ЦФ и ДНК человека
2.4. Приготовление препаратов из ККМ мышей и иммунофлуоресцентный анализ фокусов репарации ДЦР
2.5. Флуоресцентная гибридизация in situ
2.5.1. Приготовление препаратов ядер ККМ для проведения гибридизации
in situ
2.5.2. Гибридизация in situ ядер ККМ экспериментальных мышей
2.5.3. Детекция сигналов in situ гибридизации
2.6. Приготовление препаратов метафазных пластинок
2.7. Приготовление срезов ядер ККМ
2.8. Анализ распределения ККМ по клеточному циклу
2.9. Инкубирование ККМ с препаратом ДНК в системе ex vivo
2.10. Метод заливки ядер в блоки легкоплавкой агарозы
2.11. Выделение мононуклеаров
2.12. Выделение ДНК из ядер ККМ экспериментальных мышей
2.12. Количественная дот-блот гибридизация
2.13. Анализ количества зрелых предшественников (CD34+) и предшественников лимфоидного ряда в костном мозге мышей
2.14. Патологоанатомический анализ тканей и органов мышей
2.15. Приготовление меченых зондов
2.16. Статистическая обработка данных
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Характеристика временных параметров проявления эффекта токсического действия инъекций экзогенной ДНК на фоне предобработки цитостатиком ЦФ
3.1.1. Временные параметры проявления эффекта «отсроченной смерти» в группе экспериментальных мышей
3.1.2. Анализ динамики возникновения и репарации ДЦР
3.1.3. Сопоставление гибели экспериментальных животных при введении экзогенной ДНК в «окно смерти» с количеством ДЦР в ККМ
3.1.4. Анализ количества ДЦР в ККМ мышей после воздействия ЦФ в виде монопрепарата и в комбинации с экзогенной ДНК
3.2. Интернализация экзогенной ДНК в компартменты ККМ мышей

активность генов, продукты которых необходимы для входа клетки в S фазу и дальнейшего продвижения по клеточному циклу. Ключевую роль в регуляции вхождения клетки в S фазу играют белки семейства E2F и Rb. В норме Rb в середине G1 фазы фосфоршгаруется комплексом циклин D/Cdk4 (или циклин D/Cdk6), что вызывает высвобождение транскрипционных факторов E2F-1 из комплекса с Rb и их активацию (Копнин, 2000). При появлении повреждения ДНК Chk2 фосфорилирует E2F-1 по серину S364, повышая стабильность комплекса E2F-1/Rb. Также Chkl и/или Chk2 фосфорилируют Rb по серину S612, что усиливает E2F-1/Rb взаимодействие. В результате указанных событий транскрипция белков в клетке снижается, репликация сталлируется, и продвижение клетки по клеточному циклу останавливается (Stracker et al., 2009).
Последней не менее важной областью регулирования Chkl и Chk2 является запуск апоптоза клетки. Так, сверхэкспрессия E2F-1 ведет к активации проапоптотических генов и апоптотической гибели клетки. Chk2 также необходим для активации р53 - белка, который работает как фактор транскрипции, способный либо включать или выключать разветвленную сеть генов-мишеней в ответ на генотоксический стресс, либо включать программу апоптоза. р53 в дальнейшем активирует р21, который связывается с Cdk2 и Cdk4 и ингибирует активацию циклинов A, D и Е (Рис. 3). Кроме того не зависимо от взаимодействия с комплексами циклин/Cdk, р21 может арестовывать прогрессию клеточного цикла путем прямого ингибирования репликации ДНК. В этом случае белок находится в комплексе с PCNA и блокирует способность PCNA активировать ДНК полимеразу S (Lee, Bernstein, 1995).
р38МАРК/МАРКАР-К2 (МК2) комплекс является третьим эффекторным модулем, индуцирующим остановку клеточного цикла (Рис. 3) (Reinhardt, Yaffe, 2009). р38МАРК киназа в составе комплекса активируется в ответ на образование ДЦР, возникающих в процессе У(Б)1-рекомбинации в созревающих лимфоцитах и участвует в развитии остановки клеточного цикла в период G2/M фазы. Помимо активации при формировании репертуара генов иммуноглобулинов и TcR-рецепторов этот комплекс активируется в ответ на различные внешние и внутренние раздражители, такие как осмотический стресс, тепловой шок, различные токсины, УФ и ионизирующее излучения, цитокины, изменения в