Тропомиозин и альфа-актинин-4 в составе мультимолекулярных цитоплазматических комплексов, не связанных со структурами цитоскелета

• Автор: Бобков, Данила Евгеньевич
• Шифр специальности: 03.03.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 130 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

1. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ

2. ВВЕДЕНИЕ

3. ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

4.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

4Л Организация актинового цитоскелета в культивируемых клетках

4ЛЛ. Основные типы актиновых структур

4Л.2. Роль актин-связывающих белков в формировании

актиновых структур

4Л .3 Комплексы адгезии. Связь актиновых структур и сигнальных

молекул
4.2. Регуляция процессов реорганизации актинового цитосклета
4.2.1. Перестройки актинового цитоскелета клеток, распластанных на иммобилизованных лигандах
4.2.2. Регуляция структуры актинового цитоскелета малыми ГТФ-азами
4.2.3. Эффект растворимых факторов на динамику системы микрофиламентов клеток, распластанных на иммобилизованных лигандах
4.2.4. Влияние уровня активных форм кислорода на процессы реорганизации актинового цитоскелета
4.3. Структура и функции тропомиозина
4.4. Альфа-актинин
4.4.1. Структура а-актинина
4.4.2. Изоформы актининаи их субклеточная локализация
4.4.3. Участие а-актинина в адгезии
4.4.4. Образование комплексов с другими белками
4.4.5. Участие комплексов альфа-актинина в сигнальных системах
4.5. Транскрипционный фактор ОТ-кВ
4.5.1. Регуляция активности транскрипционного комплекса ХЕ-кВ
4.5.2. Сигнальные каскады, вовлеченные в активацию ЫЕ-кВ.’
4.5.3. Участие в адгезии и связь с цитоскелетом
5. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
5.1. Культивирование клеток
5.2. Конфокальная иммунофлуоресцентная микроскопия
5.3 Экстракция цитоплазматических белковых комплексов
5.4 Разделение белковых экстрактов методом гель-хроматографии
5.5. Предобработка клеток формальдегидом
5.6. Определение состава выделенных цитоплазматических белковых комплексов
5.7. Идентификация белков методом масс-спектрометрии
5.8. Обработка клеток биологически активными молекулами
5.9. Определение внутриклеточного содержания активных форм кислорода
6. РЕЗУЛЬТАТЫ
6.1. Разработка метода выделения цитоплазматических мультимолекулярных белковых комплексов без нарушения структуры актинового цитоскслста
6.2. Определение состава мультимолекулярных белковых комплексов, содержащих тропомиозин
6.3. Определение состава мультимолекулярных белковых комплексов, содержащих аль фа-акти нин
6.4. Изменение состава а-актинин-4 -содержащих комплексов в процессе реорганизации цитоскелета, вызванной различными сигнальными агентами
6.5. Корреляция между содержанием в цитозоле тропомиозип-содержащих комплексов и степенью развитости системы актиновых микрофиламентов
6.6. Влияние трихостатина на реорганизацию актинового цитоскелета и распределение тропомиозин-содержащих комплексов
6.7. Изменение уровня активных форм кислорода в процессе реорганизации актинового цитоскелета
7. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
8. ВЫВОДЫ
9. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
10. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
11. ПРИЛОЖЕНИЕ
12. БЛАГОДАРНОСТИ
1. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ
CART cytoskeleton-associated recycling or transport
СНІ calponin homology domain
СІТ2 calponin homology domain
DMEM Dulbecco’s modified Eagle’s medium
DTT dithiothreitol
EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
Ep-CAM epithelium-specific cell-cell adhesion molecule
FAK focal adhesion kinase
FITC fluorescein isothiocyanate
GFP green fluorescent protein
GRK G protein-coupled receptor kinase
HDAC7 histone dcacetylase
hnRNP heterogeneous nuclear ribonucleoprotein
TCAM-1 intercellular adhesion molecule
ICAM-2 intercellular adhesion molecule
IKK IkB Kinase
JNK jun-N-terminal kinase
LPA jiH30(|)0c4)aTHflHii0BaH khcjioth
MAGUK membrane-associated guanylate kinase scaffolding proteins
MAP mitogen-activated protein
MEKK1 MEK kinase
NF-kB nuclear factor
NIK NF-icB-inducing kinase
NLS nuclear localization signal
NMDA N-methyl-D-aspartate
OTZ 2,4-OKCHTMa3o;iHflHH
PBS phosphate-buffered saline
PDGF platelet-derived growth factor
PIP2 phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate
PMSF phenylmethylsulfonyl fluoride

эндотелиальных клетках (Nafaguchi et al., 1991). Для поиска цитоскелетных белков, взаимодействующих с ICAM-1, использовался такой же метод. Синтезированный пептид из 28 аминокислот, соответствующий цитоплазматическому домену ICAM-1, взаимодействовал с а-актинипом, но не с талином, винкулином и тензином. Очищенный а-актинин солокализуется с белком ICAM-1 в лимфоидных клеточных линиях (Carpen et al., 1992). Методом двухгибридного анализа было показано, что обе пемышечные изоформы а-актинина - первый и четвёртый - взаимодействуют с цитоплазматическим доменом ICAM-1, и это взаимодействие играет значительную роль в адгезивных свойствах лейкоцитов, оно совершенно необходимо для того, чтобы лейкоциты могли выходить сквозь стенки кровеносных сосудов в ткани (Celli et al., 2006). L-селектин прямо взаимодействует с а-актинином, но не с талином или винкулином. Интересно, что талин способствует взаимодействию а-актинина и L-селектина, но сам этот белок с ними не связываегся. Винкулин связывается с этим комплексом только в присутствии а-актинина (Heiska et al., 1996). В фокальных контактах а-актинин взаимодействует с трансмембранным прогеогликаном синдеканом-4, связывая его с системой микрофиламенгов клетки. Белки взаимодействуют независимо от ß-интегринов. а-Актинин и синдекан-4 имеют сходную локализацию, коиммупопреципитируют и связываются в опытах in vitro (Greene et al., 2003).
4.3.6. Образование комплексов с другими белками
Винкулин связывается с а-актинином в области спектрин-подобных повторов, но не с актин-связывающим доменом. С использованием серий GST конструкций был определен связывающий участок на С-конце (аминокислотные остатки 713-749), который перекрывает первый из двух кальций-связывающих ЕГ-мотива (McGregor et al., 1994).
а-Актинин взаимодействует с белками, содержащими L1M домен: зиксином и белками семейства CRP. Зиксин - актин-связывающий белок, обнаруживается в фокальных контактах. При удалении а-актинин-связывающего сайта ассоциация зиксина с фокальными контактами значительно снижается, и этот факт проясняет физиологическую роль взаимодействия а-актинин-зиксин. Двугибридный анализ показал, что N-концевой домен зиксина (аминокислотные остатки 1-42)