Сравнительная оцека адгезивной фракции клеток аспирата костного мозга, жировой ткани и пуповинной/плацентарной крови

• Автор: Волчков, Станислав Евгеньевич
• Шифр специальности: 03.03.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Оренбург
• Количество страниц: 98 с. : 45 ил.

Оглавление
ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Исторические аспекты в изучении стволовых клеток

1.2. Современные представления о стволовых клетках

1.3. Биологическая значимость стволовых клеток и их возможное применение в медицине

ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Объект исследования

2.1.1. Получение биологического материала для выделения клеток

2.1.2. Характеристика получаемого материала

2.1.3. Выделение клеток
2.1.4. Культивирование клеточного материала
2.1.5. Замораживание и оттаивание клеток
2.2. Лабораторно-методическая база исследований клеток из разных источников
2.2.1. Изучение клеточного состава биологических образцов пуповинной крови и костного мозга
2.2.2. Исследование иммунофенотипа клеток
2.2.3. Определение колониеобразующей функции
2.2.4. Исследование жизнеспособности и морфометрия клеток
2.2.5. Микроскопические методы исследования. Морфология; морфометрия, кластеризация и time-lapse
2.2.6. Исследование дифференцировочного потенциала
2.2.7. Определение функции синтеза цитокинов
2.3. Исследование клеток на биосовместимость, адгезию к имплантатам и тестирование изделий медицинского назначения
2.4. Статистическая и математическая обработка результатов исследования50 ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ
3.1. Выделение клеток из всех источников
3.1.1. Эффективность выделения клеток из пуповинной крови и костного мозга
3.1.2. Эффективность выделения клеток из жировой ткани
3.2. Культивирование клеточного материала из костного мозга, пуповинной крови и жировой ткани
3.2.1. Результаты исследования колониеобразующей функции
3.2.2. Изучение пролиферативной активности клеток

3.3. Исследование иммунофенотипа клеток
3.4. Оценка дифференцировочного потенциала клеток
3.5. Результаты оценки функции синтеза цитокинов
3.6. Исследование клеток из различных источников на биосовместимость, адгезию к имплантатам и тестирование изделий медицинского назначения.
3.6.1. Изучение адгезивной способности клеток к биоматериалам
3.6.2. Результаты тестирования средств медицинского назначения на
клетках из оптимального источника
ГЛАВА IV. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
4.1. Эффективность выделения клеток из пуповинной крови и костного мозга

4.3. Изучение колониеобразующей функции
4.4. Морфология и пролиферативная активность клеток
4.5. Иммунофенотипирование клеток
4.6. Дифференцировочный потенциал
4.7. Продукция цитокинов
4.8. Адгезивнные свойства к материалам
4.9. Сравнительный анализ клеток костного мозга, пуповинной крови и
жировой ткани
4.10. Тестирование средств медицинского; назначения на клетках опти-‘
мального источника
ВЫВОДЫ
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы
Современная медицина рассматривает область клеточных технологий как одну из самых перспективных. Со времени введения-термина «стволовая клетка» (Максимов A.A., 1908) до первого клинического применения стволовых клеток прошло более 50 лет (Thomas E.D., 1957). Сегодня в мире активно обсуждаются- вопросы клеточной медицины.: и биотехнологии. Наряду с гемопоэтическими клетками, перспективно; использование мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток, костного- мозга (MMGK) (Harrison's Principles of Internal Medicine, 17th Edition, American textbook of internal; medicine,. Kasper D;L., et al., 2008; Ichiro Sekiya, 2002). MMGK были обнаружены, среди адгезивнойгфракции-клеток стромы костного мозга (А.Я. Фриденштейн; 1968). В; экспериментах in vitro* была, показана ■ высокая пролиферативная, активность этих клеток, а также; их способность дифференцироваться; в. жировую, костную, хрящевую, нейрональную и мышечную; ткань.(Baksh D.;, et al., 2004; Bruno Delorme, 2009):* В’ отдельных экспериментах.; удавалось, дифференцировать эти ; клетки в? кардиомиоциты, гепатоциты, инсулин-продуцирующие клетки: (Paolo Bianco, 2001; Salamon A., 2009):
Создание: банков клеток позволяет, в ; качестве отдельного направления*; клеточных технологийшрименять метод тестирования различных материалов и;лекарственных средств; используемых: в медицине и трансплантологии на токсичностьи : биологическую совместимость.. (Roeker S., et al, 2009; Mans o-Silvân Mi, et.al., 2007; Ahmadi Ri, et al., 2008; Волова JI.T., 2008)
В клинической практике ММСК применяются в: гематологии: при совместной трансплантации с гемопоэтическими ; клетками для уменьшения времени приживления трансплантата и нивелирования реакции «трансплантат против хозяина» (Schäfer Ri, et al., 2009; Le Blanc K., 2004), что

инкубации с раствором трипсин-версена (Биолот, Россия) в течение 10 минут. Полученные клетки отмывались фосфатно-солевым буфером, и рассеивались в концентрации 1000 клеток на см2 посуды, пассаж 1 (Р1). В последующем культивирование проходило по стандартным методикам, максимально до пятого пассажа (Р5).
2.1.5. Замораживание и оттаивание клеток
Процедура замораживания клеток проводилась после каждого пассажа, для дальнейших экспериментов по стандартному протоколу:
Для замораживания клеток стандартную питательную среду заменяли на среду для замораживания, содержащую среду альфа MEM, 10% сыворотки (Биолот, Россия), 7% диметилсульфоксида DMSO USbio (US Biological, США). Клетки замораживали в концентрации 1-2 млн. клеток на одну 1,6мл криопробирку Cryotube (NUNC, Дания) в программном замораживателе CryoLine 560-16 (Planner, Англия) (Рис. 4) по следующей программе:
1. Охлаждение образца до +4°С со скоростью 10 С°/мин.
2. Охлаждение до -8°С, со скоростью 5С°/мин; 3.Охлаждение до -14°С, со скоростью 15°С/мин; 4.Охлаждение до -50°С, со скоростью 1°С/мин.
По окончании программы клетки переносили в криохранилище CBS 3000V (CryoBioSystems, США) для хранения при температуре -196°С.
Оттаивание клеток проводилось в условиях термостатируемого инкубатора с ротационным столиком Lab-Line MaxQ 4450 (Thermo Scientific, США) при температуре 37-40°С в течение 2-5 минут, до достижения 4°С, затем клетки быстро отмывались фосфатно-солевым буфером. После отмывания проводили подсчет с определением жизнеспособности на клеточном анализаторе Vi-Cell XR (Becman Coulter, США), затем клетки рассеивались на следующий пассаж.