Пути дифференцировки нативных и генетически модифицированных мононуклеаров пуповинной крови человека в регенерирующей печени крыс

• Автор: Андреева, Дина Ивановна
• Шифр специальности: 03.03.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Казань
• Количество страниц: 108 с. : 24 ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
1 ВВЕДЕНИЕ

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1 Клеточные источники регенерации печени

2.1.1 Эпителиальные клетки печени

2.1.2 Тканевой резерв стволовых клеток печени

2.1.3 Внепеченочные стволовые клетки в регенерации печени

2.1.3.1 Клетки костного мозга

2.1.3.1.1 Гемопоэтические стволовые клетки

2.1.3.1.2 Мезенхимальные стволовые клетки

2.1.3.2 Стволовые клетки пуповинной крови
2.2 Слияние или трансдифференцировка
2.3 Генетическая модификация стволовых клеток
2.3.1 Вирусная трансфекция
2.3.2 Химическая трансфекция
2.3.3 Физическая трансфекция
2.3.4 Трейсерный зеленый флуоресцентный белок
2.4 Модели регенерации печени
2.4.1 Частичная гепатэктомия
3 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1 Получение мононуклеаров пуповинной крови человека
3.1.1 Получение концентрата клеток пуповинной крови человека
3.1.2 Выделение фракции мононуклеаров из пуповинной крови человека
3.1.3 Подсчет количества и определение жизнеспособности ядросодержащих клеток
3.2 Генетическая модификация мононуклеаров пуповинной крови
человека
3.2.1 Клонирование гена EGFP в экспрессионные плазмидные вектора pcDNA
3.2.2 Сравнение методов генетической модификации
клеток пуповинной крови человека
3.2.2.1 Трансфекция с использованием Escort V
3.2.2.2 Трансфекция с использованием TransFast
3.2.2.3 Физический метод трансфекции - электропорация
3.3 Объекты исследования
3.4 Гистологические и иммуногистохимические методы исследования
3.4.1 Депарафинирование и регидратация парафиновых срезов
3.4.2 Окрашивание гематоксилин-эозином
3.4.3 Окрашивание парафиновых срезов печени крысы антителами к а-ГМА
3.4.4 Окрашивание парафиновых срезов печени крысы
антителами к альфа-фетопротеину

3.4.5 Окрашивание парафиновых срезов печени крысы
антителами к НБА, СК19
3.4.6 Окрашивание парафиновых срезов печени крысы
антителами к БОБР
3.4.7 Окрашивание парафиновых срезов печени крысы антителами к НЬА-АВС, С-кй
3.4.8 Двойное иммуногистохимическое окрашивание
парафиновых срезов печени антителами против
ЕОБР и цитокератина19, и С-кй и десмина
3.4.9 Определение числа С-кй позитивных клеток
4 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
4.1 Активация стволового компартмента в регенерирующей
печени крыс
4.1.1 Экспрессия С-кй в печени крыс после ЧГ
4.1.2 Экспрессия С-кй в печени крыс после ЧГ и
трансплантации мононуклеаров пуповинной крови человека
4.2 Распределение мононуклеаров пуповинной крови человека
в печени крыс
4.3 Анализ возможности трансформации мононуклеаров пуповинной крови человека в миофибробласты после трансплантации в печень крыс
4.4 Возможность генетической модификации мононуклеаров пуповинной крови человека

пуповинной крови человека с фенотипом CD34+CD38- [129]. В качестве модельного вектора был применен рекомбинантный лентивирус, экспрессирующий репортерный белок GFP. Средняя эффективность экспрессии трансгена GFP составила 59±7%. Большинство эритроидных и миелоидных колоний, полученных из инфицированных CD34+CD38- клеток, экспрессировали ген GFP. Несмотря на значительный опыт, накопленный в области применения ретровирусных векторов для инфицирования CD34+ гемопоэтических клеток, ученые продолжают работы по дальнейшей оптимизации данной вирусной системы, о чем свидетельствуют работы по данной тематике [189].
Как было отмечено выше, использование вирусных методов доставки генетического материала в клетки ограничено возможными иммунологическими и онкогенными побочными эффектами.
2.3.2 Химическая трансфекция
Одним из распространенных подходов к химической трансфекции разных клеточных линий считается применение катионных липидов или полимеров. Данный метод основан на образовании липосомных комплексов, способных проникать сквозь плазматическую мембрану клеток. Преимуществом метода считается относительная простота его исполнения и доступность необходимого оборудования. Эффективность
низкомолекулярных полиэтилениминов для трансфекции невирусных систем была показана на примере гемопоэтических клеточных линий и CD34+ клеток пуповинной крови человека [170]. Более того, клетки, трансфецированные с помощью низкомолекулярных полиэтилениминов, показали хорошую жизнеспособность.
Сравнение эффективности трансфекции клеток с помощью полиэтиленаминов и реагента Lipofectamine 2000 (Invitrogen) показало более высокий уровень экспрессии гена GFP (до 23 раз) в различных клеточных культурах, включая CD34+ клетки пуповинной крови после трансфекции с помощью полиэтилениминов.