Экспрессия нативного и модифицированного генов иммунного интерферона быка в клетках дрожжей Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris

• Автор: Градобоева, Анастасия Евгеньевна
• Шифр специальности: 03.03.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 130 с. : ил.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АГ - аппарат Гольджи

ИЛ - интерлейкин '

ИФН - интерферон

КФ - кислая фосфатаза

ПААГ-полиакриламидный гель

ПЕП - полная среда без неорганического фосфата

ПЕГІФО - полная среда с неорганическим фосфатом

ПСА - персульфат аммония

ПЭГ - полиэтиленгликоль

ТЕМЕД - ГГГфГГ'ТЧ-тетраметилэтилендиамин

ТХУ - трихлоруксусная кислота
ФНО - фактор некроза опухоли
ЭР - эндоплазматический ретикулум
bIFNG — структурный ген ИФН-у быка
BSA - бычий сывороточный альбумин
DTT - дитиотреитол
EDTA - этилендиаминтетрауксусная кислота
GuHCl - гуанидина гидрохлорид
HuIFNG - структурный ген ИФН-у человека
2-МЭ - 2-меркаптоэтанол
PMSF - фенилметилсульфонилфторид
SDSOICH) - додецилсульфат натрия
ТВЕ -трис-боратный буфер
ТЕ - 0.01М трис НС1, содержащий 0.001М ЭДТА, pH
ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
ПРОДУКЦИЯ ИНТЕРФЕРОНОВ МЛЕКОПИТАЮЩИХ В КЛЕТКАХ ДРОЖЖЕЙ
1. ИНТЕРФЕРОНЫ
1.1. Классификация интерферонов
1.2. Интерферон-гамма и его роль в системе интерферонов
1.3. Механизм действия интерферонов
1.3.1. ОАК-БТАТпуть передачи сигнала в ядро
1.3.2. Структура рецепторов интерферонов
1.3.3. Пути проникновения комплекса интерферон/рецептор в клетку
1.3.4 Транспорт интерферонов в ядро, сигналы ядерной локализаци
1 АПрименение интерферонов
2. СОЗДАНИЕ ВЕКТОРОВ И ШТАММОВ ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕТЕРОЛОГИЧНЫХ ГЕНОВ
2.1. Клонирование чужеродных генов в микроорганизмах
2.2. Гетерологичная экспрессия в дрожжах
2.2.1. Особенности роста дрожжей Б. сегез?1з!ае и Р. равЮпв
2.2.2. Промоторы, обеспечивающие высокий уровень экспрессии
2.2.3. Векторы для экспрессии чужеродных генов в дрожжах
2.2.4. Особенности секреции, гликозилирования и протеолиза белков у дрожжей
3. ВЛИЯНИЕ ПРОДУКЦИИ ГЕТЕРОЛОГИЧНЫХ БЕЛКОВ НА КЛЕТКИ ДРОЖЖЕЙ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. МАТЕРИАЛЫ

1.1 Штаммы
1.2 Плазмиды
1.3 Условия культивирования штаммов
2. МЕТОДЫ
2.1 Трансформация бактерий E
2.2 Трансформация дрожжей плазмидной ДНК
2.3 Выделение плазмидной ДНК из клеток Д
2.5 Электрофорез ДНК
2.7 Выделение хромосомной ДНК из дрожжей
2.8 Полимеразная цепная реакция
2.9 Количественное определение активности кислых фосфатаз
2.10 Определение концентрации белка
2.11 Электрофорез белков в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия
2.12 Электроперенос белков с полиакриламидного геля на нитроцеллюлозу
2.13 Иммуноблот со специфическими антителами
2.14 Г ель-фильтрация на сефакриле S
2.15 Определение биологической активности
РЕЗУЛЬТАТЫ
1. СОЗДАНИЕ ШТАММА ДРОЖЖЕЙ S. СERE VISIAE -ПРОДУЦЕНТА ИФН-у БЫКА
1.1 Характеристики штаммов-реципиентов
1.2 Измерение активности кислых фосфатаз у штаммов-реципиентов
1.3 Получение штаммов-продуцентов ИФН-у
1.3.1 Трансформация штаммов плазмидойpYGIB
1.3.2 Оценка митотической стабильности плазмиды pYGIB
1.3.3 Тестирование продукции ИФН-у

Для достижения высокого уровня гетерологичной экспрессии штаммы-продуценты с фенотипом Mut- выращивают в две стадии: наращивают биомассу на среде с глицерином, а затем переносят на среду с метанолом. Во время первой стадии синтез чужеродного белка подавлен за счет присутствия в культуральной среде глицерина, и клетки активно растут, не испытывая дополнительной метаболической нагрузки. На второй стадии в присутствии метанола запускается синтез чужеродного белка.
Ферментация в две стадии обеспечивает высокую продукцию даже тех белков, которые считаются токсичными для клетки-продуцента: поверхностного антигена гепатита В (Cregg et al., 1987), стрептокиназы (Hagenson et al., 1989) и др. Это достигается прежде всего за счет четкой регуляции транскрипции гена, клонированного под контролем промотора АОХ1.
Во втором случае (рис.бВ) в локус АОХ1 встраивается вся плазмида с сохранением гена Л 077/.
В третьем случае (рис. 6С) экспрессионную кассету встраивают в локус
HIS4.
Получаемые трансформанты способны полноценно усваивать метанол, так как сохраняется нативный ген АОХ1 (фенотип Mut+). Наращивание биомассы и индукцию экспрессии клонированного гена у Mut+ трансформантов осуществляют, культивируя клетки на среде с метанолом и глицерином в низкой концентрации.
Для многих белков показано, что уровень продукции не зависит от того, в какой локус встроен ген. Однако, преимуществом штаммов Mut-является их стабильность, в то время как штаммы Mut+ способны терять чужеродный ген (Romanos et al., 1992).
Несмотря на то, что для P. pastoris нет высококопийных эписомальных плазмид, существуют способы получения штаммов, содержащих множественные встройки экспрессионной кассеты, что позволяет повысить