Проблемы стандартизации при получении клеточных культур мезенхимального происхождения : экспериментальный и теоретический анализ

• Автор: Бурунова, Вероника Вячеславовна
• Шифр специальности: 03.03.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 213 с. : ил.

Содержание
Введение.

Актуальность проблемы.

Цель работы.

Задачи исследования.

Научная новизна работы.

Практическая значимость работы.

Внедрение в практику.

Апробация диссертационной работы.

Научные публикации по теме диссертации.

Структура диссертационной работы.
Часть I. Обзор литературы по теме диссертационной работы.
Глава 1.1. Типы стволовых клеток и источники их выделения.
§ 1.1.1. Основные характеристики стволовых клеток.
Концепция существования стволовых клеток.
Способность к дифференцировке.
Трансдифференцировка.
§1.1.2. Эмбриональные стволовые клетки.
История открытия эмбриональных стволовых клеток. 17 Общая характеристика эмбриональных стволовых, клеток. 20 § 1.1.3. Фетальные стволовые клетки.
Источники фетальных стволовых кчеток.
Фетальные пренатальные стволовые клетки.
Фетальные перинатальные стволовые клетки.
§ 1.1.4. Региональные стволовые клетки.
Мезенхимальные стволовые клетки.
Нейрональные стволовые клетки.
Гемопоэтические стволовые клетки.
Клетки-предшественники эндотелия.
Индуцированные плюрипотентные клетки.

Глава 1.2. Области применения клеточной терапии.
§ 1.2.1. Перспективы медицинского применения клеточных ^
материалов мезенхимального происхождения.
Лечение заболеваний опорно-двигательного аппарата.
Применение КМ мезенхимального происхождения в неврологии.
Применения КМ мезенхимального происхождения при восстановлении повреждений сердца и лечения сердечно-
сосудистых заболеваний.
Использование КМ мезенхимального происхождения для лечения заболеваний печени.
Иммуномодулирующие свойства клеточных материалов ^
мезенхимального происхоэ/сдения.
Применение клеточных материалов мезенхимального происхождения в эстетической медицине, а также для
лечения заболеваний кожи.
§ 1.2.2. Современное состояние законодательной базы в области производства, стандартизации и применения клеточных
материалов.
Отсутствие понятия «клеточный материал» в базовых законах Российской Федерации, регулирующих
производство клеточных материалов.
Создание законодательной базы в области производства, ^
стандартизации и применения клеточных материалов.
Международные нормы правового регламентирования деятельности в области клеточных технологий.
Часть II. Материалы и методы исследований. Глава П.1. Методы культивирования клеток.
§ II. 1.1. Получение первичных культур мезенхимальных клеток.
Выделение фибробластов из кожи человека.
Выделение кератиноцитов из кожи человека.
Выделение мезенхимальных клеток из костного мозга

человека.
Выделение мезенхимальных клеток из плаценты человека.
Выделение мезенхимальных клеток из пуповины человека.

§ II. 1.2. Культивирование первичных клеточных культур мезенхимального происхождения in vitro.
Пассирование мезенхимальных клеток.
Долговременная криоконсервация клеток.
Определение концентрации клеток в камере Горяева.
§ II. 1.3. Дифференцировка клеток мезенхимального происхождения in vitro.
Остеогенная дифференцировка мезенхимальных стволовых клеток человека.
Хондрогенная дифференцировка мезенхимальных стволовых кчеток человека.
Адипогенная дифференцировка мезенхимальных стволовых клеток человека.
Глава II.2. Биохимические и цитологические методы.
§ II.2.1. Биохимические методы.
Окраска исключающихt витальным красителем трипановым синим.
Индикация дегидрогеназной активности с помощью калорш гетрического МТТ-теста.
Индикация фосфата кальция методом окрашивания по Ван Коссу.
Индикагщя коллагена методом окрашивания толуидиновым синим.
Индикация липидов методом окраски масляным красным.
§ II.2.2. Цитогенетические методы.
Получение препаратов для цитогенетического анализа.
Анализ хромосомного состава клеток.
§ II.2.3. Иммуноцитохимические методы.
Иммуноцитохимическая детекция поверхностных и внутриклеточных маркёров.
Иммуноцитохимическая детекция маркёров клеточной дифференцировки.
Проточная цитофлуориметрия.

Мезенхимальные СК (МСК) содержатся в различных компартментах пуповины: они были выделены из
пуповинной крови (см. выше), из
венозного субэндотелиального слоя, но наибольшее их количество, было получено из Вартонова студня, включая /сосуды, пери- и интраваскулярное пространство [Karahuseyinoglu-07]. Выделенные из Вартонова студня клетки способны к самообновлению и дифференцировке, т.е. отвечают самым главным критериям
определения СК [Mitchell-ОЗ].
МСК из пуповины экспрессируют маркёры плюрипотентности [Carlin-Об] и могут дифференцироваться in vitro в
клетки различных органов и тканей. Разумеется, классические пути дифференцировки МСК - остеогенная, адипогенная и дифференцировка в хрящ - были успешно опробованы на МСК из пуповины сразу, как только исследователи обратили на них своё внимание [Romanov-ОЗ]. Несколько позже была показана их способность дифференцироваться в нейрональные клетки, что было подтверждено и морфологически, и биохимически [Fu Y.S.-04, MaL.-05], МСК из пуповины были также продифференцированы в кардиомиоциты [Kadivar-06], скелетные мышцы [Kobayashi-98] и- даже в эндотелиальные клетки [Li Y.S.-90].
§ 1.1.4. Региональные стволовые клетки.
Развитие регенеративной медицины и тканевой инженерии требует новых подходов и стратегий для эффективной терапии или даже замещения
Рисунок 13. Поперечный разрез пуповинного канатика,
соединяющего зародыш с плацентой: изображены
сосудистая сеть, состоящая! из двух артерий и одной вены, а также вартонов студень, содержащий множество МСК (из [Рарра-09] с изменениями).