Экспериментально-морфологическое обоснование консервации трупных донорских роговиц в условиях вакуума при гипотермии для выполнения сквозных и послойных кератопластик

• Автор: Казённов, Алексей Николаевич
• Шифр специальности: 03.03.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Оренбург
• Количество страниц: 76 с. : 30 ил.

Оглавление
ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1 Современные представления о методах консервации роговицы

для осуществления кератопластики (Обзор литературы)

1.1 Классификация методов трансплантации, основных методов консервации роговицы и оценки ее жизнеспособности

1.2. Информативность различных методов оценки жизнеспособности роговицы

1.3. Преимущества и недостатки основных методов консервации донорской роговицы

ГЛАВА 2 Материал и методы исследования

2.1 Общая характеристика объекта исследований

2.2 Консервация роговицы

2.3 Культивирование по Ф.М. Лазаренко

2.4 Послойная кератопластика
2.5 Светооптическое исследование
2.6 Электронно-микроскопическое исследование
2.7 Иммуноцитохимическое исследование
ГЛАВА 3 Результаты собственных исследований
3.1 Светооптическая и ультраструктурная характеристика донорских роговиц, консервированных в условиях вакуума
3.2 Экспериментально-гистологические исследования биологических свойств роговичных трансплантатов в условиях культивирования in vivo по методу Ф, М. Лазаренко
3.3 О возможности применения донорских роговиц, консервированных в условиях вакуума, для целей офтальмохирургии
ГЛАВА 4 Обсуждение полученных результатов
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы
Более 100 лет прошло со дня первой успешной сквозной пересадки роговицы, выполненной Э. Цирмом, однако и в настоящее время наибольшее распространение в области трансплантологии остается за кератопластикой (Плескова A.B., Хватова A.B., 2002). Высокая потребность в кератопластике приводит во всем мире к возрастанию потребности в пластическом материале и в совершенствовании методов его консервации (Каспаров A.A., Магден Ю., 2001; Heck E., Krachmer J.H., Mannis M.J. Holland E.J., 2005). В связи с возросшим риском опасных инфекций и повышенных требований к качеству трансплантационного материала необходимо полноценное его обследование, требующее дополнительных затрат времени, что, в свою очередь, вызывает необходимость кратковременной консервации с гарантией сохранения жизнеспособности трансплантата (Сурков A.A., 2003).
Как только в трансплантационной хирургии возросли требования к пересаживаемому материалу, возникла необходимость в создании и развитии службы заготовки и консервации донорских тканей. Огромный вклад в создание сегодняшних глазных банков во всем мире внес академик В.П. Филатов. Он создал и возглавил первую специализированную лабораторию консервации тканей при Одесском научно-исследовательском Институте глазных болезней. Им в 1934 году было предложено донорское глазное яблоко хранить в стеклянном сосуде при температуре +2-+4°С.
Существует множество методов консервации роговицы, однако не все они нашли широкое распространение. Один из методов, который продолжают использовать и в настоящее время, заключается в обезвоживании роговичных трансплантатов над силикагелем (Волков В.В., Шиляев В.Г., 1976; Гольфельд Н.Г., 1976). Метод' прост и позволяет длительно сохранять трансплантационный материал, однако консервированная роговица лишена жизнеспособности.
Предлагались использовать в качестве консервантов различные жидкие среды. Офтальмологам Мак Кери и Кауфман (1974) удалось создать среду, названную в их честь, которая позволила надежно консервировать роговицу на срок до 96 часов. В последующем появились ее производные с более длительным сроком хранения: Chondroitin Sulphate (Kaufman Н.Е., 1984), К-sol (Lindstrom R.L., 1990), Dexol (Lindstrom R.L., 1990), Optisol
(Williams K.A., Coster D.J., 1993), среда Борзенка-Мороз (Борзенок C.A., Мороз З.И., Комах Ю.А. и др., 2002).
Технические достижения к настоящему времени позволили предложить такие методы консервации роговицы, как криоконсервация (-196°С) в жидком азоте с использованием различных крио-протекторов (Дронов М.М., 1987; Williams К.А., Muehlberg S.M., Lewis R.F., CosterD.J., 1995), гипербарическая оксигенация при гипотермии (Линник Л.Ф., Подопригора Р.Н., 1976), в вакууме (Канюков В.Н.,ра Р.Н., 2006), в том числе контейнеры с наноструктурированным углерод содержащим покрытием (Мусина А.Д., 2006).
До настоящего времени не существует единого мнения относительно наилучшего способа сохранения роговицы человека. Значительное количество существующих методик консервации роговицы свидетельствует об отсутствии совершенных технологий. Следует также отметить недостаточные морфологические обоснования предложенных методик в аспекте изучения диапазона изменчивости ткане- и органоспецифичности консервируемых объектов. Все это стимулирует дальнейший поиск в этом направлении.
Учитывая положительные результаты консервации донорской роговицы путем лиофилизации с последующим прозрачным приживлением послойных трансплантатов (Бордюгова Г.Г., 1980; Илаговская Л.В., 1980), мы сочли целесообразным провести исследования по разработке метода консервации роговицы в вакууме при гипотермии.

2.5 Светооптическое исследование
Эксцизивные фрагменты участков роговицы фиксировали в 10% водном растворе нейтрального формалина. После стандартной гистологической проводки материал заливали в парафин-целлоидин. Приготовление серийных срезов толщиной 5-6 мкм осуществляли на ротационном микротоме. Депарафинированные срезы окрашивали гематоксилином Майера и эозином с последующим анализом и микрофотографированием при помощи цифровой фотокамеры Canon IXUS 800 IS.
2.6 Электронно-микроскопическое исследование
Материал фиксировали в охлажденном (t°+4°C) 2,5% растворе
глютарового альдегида на S-коллединовом буфере (рН=7,3). Постфиксацию проводили в 1% растворе четырехокиси осмия по Mi Honig (1961). В дальнейшем кусочки обезвоживали при комнатной температуре в серии спиртов возрастающей крепости (50°-100°) и абсолютном этаноле, после чего заключили в смолу ЭПОН-812 (Уикли, 1975). Полимеризацию объектов проводили при t°+60°C (в течение 3-х суток). С каждого блока на ультратоме УМТП-4 получали полутонкие срезы (1 мкм), которые окрашивали метиленовым синим и основным фуксином по прописи Sato et Shamoto (1973). Полутонкие срезы использовали при подготовке блоков к прицельной заточке, необходимой для изготовления ультратонких срезов (40-60 нм) на ультратоме LKB-5 (Sweden-Bromma).
Ультратонкие срезы подвергали двойному контрастированию в насыщенном растворе уранилацетата при t°+37°C в течение 30 минут и цитрате свинца по Reynolds (1963). Изучение ультратонких срезов и их фотографирование производили на электронном микроскопе ЭМВ 100АК при увеличении OT'xS 000 до *40 000.