Комплекс методов исследования NK-клеток в норме и при патологии

• Автор: Муругин, Владимир Владимирович
• Шифр специальности: 03.03.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 116 с. : 18 ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Общая характеристика МК-клеток
1.2. Лигические гранулы
1.3. Рецепторы МК-клеток
1.4. Дифференцировка и обучение МК-клеток
1.5. Активация МК-клеток и иммунологический синапс (ИС)
1.6. Механизмы цитолитического действия МК-клеток
1.7. Первичные иммунодефициты, сопровождающиеся нарушением активации и дегрануляции МК-клеток
1.8. Хроническая гранулематозная болезнь
1.9. Инфекция, вызываемая вирусами простого герпеса
1.10. Методы исследования дегрануляции МК-клеток
1.11. Резюме по обзору литературы
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Характеристика обследованных групп
2.2. Реактивы, расходные материалы и оборудование
2.3. Забор крови и выделение мононуклеарных клеток
2.4. Культивирование клеток К
2.5. Определение дегрануляции МК-клеток по экстернализации СОЮ7а
2.6. Определение ИК-активности МНК
2.7. Внутриклеточная окраска на СОЮ7а и перфорин
2.8. Сочетанный анализ дегрануляции и внутриклеточной экспрессии перфорина и гранзима А
2.9. Статистическая обработка результатов
3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Отработка условий теста на экстернализацию СОЮ7а
3.2. Валидация СЛ3107а как маркера дегрануляции ИК-клеток
3.3. СБбЗ как маркер дегрануляции МК-клеток
3.4. Определение совокупности методов для исследования МК-клеток. Нормативные показатели
3.5. Показатели функционального состояния МК-клеток у лиц пожилого возраста
3.6. Показатели функционального состояния МК-клеток при первичных иммунодефицитах

3.7. Показатели функционального состояния КК-клеток при часто рецидивирующем герпесе
3.8. Фенотип дегранулирующих МС-клеток
3.9. Сопоставление дегрануляции с другими признаками активации МК-клеток
4. ОБСУЖДЕНИЕ
4.1. Методологические аспекты
4.2. Гетерогенность КК-клеток в тесте на дегрануляцию
4.3. Изменения функциональных показателей ИК-клеток при исследованных заболеваниях и состояниях
4.4. Заключение
5. ВЫВОДЫ
6. БЛАГОДАРНОСТЬ
7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АЗКЦТ - антителозависимая клеточная цитотоксичность;
БСА - бычий сывороточный альбумин;
ВПГ - вирус простого герпеса;
ГФС - гемофагоцитарный синдром;
ДАГ - диацилглицерол;
ИЛ - интерлейкин;
ИОН - иономицин;
ИС - иммунологический синапс;
ИФН - интерферон;
ЛЕ2о - литическая единица-20 (количество зффекторных клеток, необходимое для киллинга 20% мишеней);
МАТ - моноклональное антитело;
МИК - мононуклеарные клетки;
НАДФ - никотинамидадениндинуклеотид фосфат;
НАДФН - никотинамидадениндинуклеотид фосфат восстановленный;
ИКС - полная культуральная среда;
ИТС - параллельные тубулярные структуры (parallel tubular arrays);
СВО - синдром Вискотга-Олдрича;
СГЛ - семейный гемофагоцитарный лимфогистиоцитоз;
СИФ - средняя интенсивность флуоресценции;
СЧХ - синдром Чедиака-Хигаси;
ФАТ - фактор активации тромбоцитов ФМА - форбол-12-миристат-13-ацетат;
ФНО - фактор некроза опухолей;
ФСБ — фосфатно-солевой буфер;
ФСБ-Д - фосфатно-солевой буфер в модификации Дульбекко;
ХГБ - хроническая гранулематозная болезнь;
ЦБ - цитохалазин Б;
ЦТ - циклогексимид;
ЦОМТ - центр организации микротрубочек;
ЦТЛ - цитотоксический лимфоцит;
ЧРГ - часто рецидивирующий герпес;
Э:М - соотношение эффектор:мишень;
CCR - C-chemokine receptor (рецептор С-хемокинов);
CD - cluster of differentiation (кластер дифференцировки);
CFSE - 5(6)-carboxyfluorescein diacetate N-succinimidyl ester (5-,6-карбоксифлуоресцеиндиацетат-сукцинимидиловый эфир); cSMAC - central supramolecular activation complex (центральный супрамолекулярный активационный комплекс);
DNAM-1 - DNAX accessory molecule-1 (вспомогательная молекула, открытая в фирме DNAX);
FasL - Fas ligand (лиганд антигена Fas);
FITC - fluorescein isothiocyanate (флюоресцеина изотиоцианат)
FILA - human leukocyte antigens (антигены лейкоцитов человека; название главного комплекса гистосовместимости у человека);
ICAM - intercellular adhesion molecule (межклеточная молекула адгезии);
Ig - immunoglobulin (иммуноглобулин);

Src-киназ, причем это фосфорилирование происходит независимо от активации WASP через Cdc42 [60, 206].
При СВО в результате мутаций белок WASP либо полностью отсутствует, либо синтезируется его усеченная, нефункционирующая форма, что приводит к нарушению внутриклеточной передачи сигнала, изменению формы клеток и их движения [43].
Клиника СВО характеризуется классической триадой симптомов: тромбоцитопения, экзема и иммунодефицитное состояние, которое проявляется рецидивирующими бактериальными инфекциями (в частности, пневмококковыми) и вирусными инфекциями (в частности, герпесвирусными) [160]. Вследствие низкого содержания тромбоцитов в крови возникают петехии и кровотечения из слизистых оболочек, в том числе желудочно-кишечного тракта. У 40% больных СВО развиваются аутоиммунные заболевания: гемолитическая анемия, аутоиммунная тромбоцитопеническая пурпура, аутоиммунная нейтропения, артриты, васкулиты малых и крупных кровеносных сосудов, аутоиммунное поражение почек и печени. У больных СВО, особенно инфицированных вирусом Эпштейна—Барр, повышен риск лимфом головного мозга, легких и желудочно-кишечного тракта, а также развития гемофагоцитарного синдрома. Диагноз СВО ставят по результатам Вестерн-блоттинга или проточно-цитометрического анализа, при которых выявляют снижение или полное отсутствие экспрессии белка WASP.
Иммунологические нарушения при СВО разнообразны и могут быть объединены в следующие группы [43]: 1) нарушение образования ИС Т- и NK-клетками, что ведет к дефектам их активации и неспособности элиминировать вирус-инфицированные клетки; 2) нарушение продукции Т-клеток в тимусе; 3) нарушение дифференцировки и/или функций В-клеток, в частности снижение продукции антител к полисахаридным антигенам, что ведет к снижению резистентности к капсулообразующим бактериям, например к пневмококку; 4) нарушения (фагоцитоза; 5) нарушения хемотаксиса различных клеток иммунной системы.
Повышенная восприимчивость больных СВО к герпесвирусным инфекциям и повышенная частота лимфом косвенно указывает на дефект