Физиологические эффекты кадмия на модели виргинских устриц : Crassostrea virginica

• Автор: Иванина, Анна Валерьевна
• Шифр специальности: 03.03.01
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Казань
• Количество страниц: 122 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Биологическое действие кадмия
1.2 Использование кадмия в медицине
1.3 Устрицы, как модель исследования
2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1 Материалы исследований
2.2 Методы исследований
2.3 Результаты собственных исследований
2.3.1 Распределение кадмия в клетках жабер и гепатопанкреаса устриц в условиях in vivo и in vitro
2.3.2 Аэробный и анаэробный метаболизмы виргинских устриц при воздействии кадмия хлорида
2.3.3 Защитные механизмы клетки при воздействии кадмия
3 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ СОБСТВЕННЫХ
ИССЛЕДОВАНИЙ
ВЫВОДЫ
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕЛОЖЕНИЯ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АДФ - аденозиндифосфат
АСК - АТФ связывающие кассеты
АТФ - аденозинтрифосфат
АЭЗ - аденилатный энергетический заряд
БСМ - базальная скорость метаболизма
БТШ - белок теплового шока, соответственно с молекулярной массой
60 (БТШ 60), 70 (БТШ 70), 90 (БТШ 90) и 100 (БТШ 100) кДа
ДДС-Na -додецилсульфат натрия
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
ДТТ-дитиотреол
ДЭБ - динамичность энергетического бюджета
МКУ - устойчивость к мультиксенобиотикам
МТ - металлотионеины
П-гп - П-гликопротеин
ПЦР - полимеразная цепная реакция
РБ - родамин Б
Р123 - родамин
РНК - рибонуклеиновая кислота
РЭ БТШ - регуляторный элемент БТШ
ССМ - скорость стандартного метаболизма
ФМСФ - фенилметилсульфонилфлюорид
ЭГТА-этиленгликолтетрауксусная кислота
ЭДТА- этилендиаминтетрауксусная кислота
ЭТЦ - электронтранспортная цепь
HEPES - 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота
МО2- скорость стандартного метаболизма
РОг- парциальное давление кислорода в гемолимфе

ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы. Кадмий обладает разносторонними биологическими свойствами (Thevenod F., 2009; Hyun S. et al., 2006 и др.). Это достаточно «сложный» элемент; отношение к нему медицинских и ветеринарных специалистов достаточно осторожное, поскольку он хорошо известен своей токсичностью. При этом его относят как к группе «новых» микроэлементов (кадмий, ванадий, кремний, олово, фтор), так и, наряду с РЬ, Sn и Rb, к условно необходимым микроэлементам и в низких концентрациях он способен стимулировать рост (Авцын А.П. и др., 1991; Скальный A.B., 2004). В последние годы возрос интерес отечественных исследователей к кадмию, рассмотрены его физиологические эффекты на сельскохозяйственных животных (Савчук С.В., 2003; Матиосов А.Д., 2004; Артемьева O.A., 2005; КияеваЕ.В., 2010).
Механизмы действия кадмия охватывают большое число критических физиологических, в первую очередь клеточных, функций. Он влияет на многие процессы организма, в том числе метаболические, путем прямого и опосредованного действия на регуляторные механизмы, образуя прочные комплексы с аминокислотами и другими биомолекулами, содержащими HS-и RS-группы, заменяя металлы в содержащих их ферментах (Виеелина Т.Н., Лукьянова О.Н., 2000; Андриянова Е.Е., Куличенко И.С., 2002; Amiard J.C., et al. 2006 и др.). Полагают, что действие кадмия связано не только с его физиологической активностью, но и способностью вытеснять другие жизненно необходимые для организма микроэлементы, такие как цинк, медь, железо (Pinot F et al., 2000; Hodgson A., 2010).
Между тем, действие кадмия на морских гидробионтов, в частности
устриц, которые концентрируют его в значительном количестве, изучено
мало. Недостаточно сравнительных сведений, раскрывающих механизм
эффектов кадмия на организменном, тканевом и клеточном уровнях. В связи
с вышеизложенным, изучение особенностей физиологического действия

жабры или гепатопанкреас из контрольной или опытной групп устриц гомогенизировались в соответствующем буфере.
Для выделения мРНК использовали Tri Reagent. РНК очищалась от примеси ДНК с помощью набора DNA-Free RNA Kit (“Zymo-Research”, США). Для синтеза кДНК к РНК добавляли 1 мкл 10 мМ dNTP; 200 нг Oligo (dT)ig праймеров; 4 мкл 5x-First Standart буфера; 1 мкл ОД М ДТТ; 1 мкл ингибитора РНКазы RNAseOUT (“Invitrogen”, США) и 1 мкл 2 ООО ед / мкл обратной транскриптазы Superscript III (“Invitrogen”, США).
Белок выделяли из тканей или изолированных клеток жабер или гепатопанкреаса. Ткани (клетки) растирали на льду в стеклянных гомогенизаторах Поттера-Эльвейема в экстрагирующем буфере. Гомогенат разрушали ультразвуком 3 раза по 10 с, затем центрифугировали 10 мин при 14 000 g. Далее белки из супернатанта растворяли в соответствующем буфере и кипятили в течение 5 мин. В белковых образцах определяли содержание белка и наносили на гель, предварительно определив и выровняв их концентрации по методу Bredford М. (1976).
Электрофорез проводили в блоках полиакриламидного геля размером
70x80x1 мм в модифицированной системе Laemmli U.K. (1970). В качестве
стандарта использовали белковый маркер pageRuler Prestained Protein Ladder
Plus (“Fermentas”, США). Для переноса белков использовали
нитроцеллюлозную мембрану (“Santa Cruz Biotechnology, Inc.”, США) с
диаметром пор 0,45 мкм. Перенос белков после электрофоретического
разделения на нитроцеллюлозную мембрану проводили в буфере для
переноса. В качестве первичных антител использовали для БТШ 70 - МАЗ-
007 (“Affinity Bioreagent”, США), для БТШ 90 - SPA-835 (“StressGen
Bioreagents”, США), БТШ 60 - SPA-805, (“StressGen Bioreagents”, США), для
П-гп - С219 (“Signet”, США), для маркера клеточной мембраны EGRF
(рецептор фактора роста эпителия) - NB120-10414 (“Novus Biological Inc.”,
США), маркер митохондрий - комплекс IV субъединица а-СОХ
(“MitoSciences”, США). В качестве вторичных антител использовали