Роль Rho-киназы и протеинкиназы C в регуляции сокращения подкожной артерии новорожденных и взрослых крыс

• Автор: Мочалов, Степан Вячеславович
• Шифр специальности: 03.03.01
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 161 с. : ил.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Гладкая мышца: роль в регуляции тонуса сосудов ц артериального давления
1.2 Регуляция концентрации Са2+ в цитоплазме гладкомышечных клеток
1.2.1 Механизмы повышения Са2+в цитоплазме гладкомышечных клеток
1.2.2 Механизмы снижения Са2+ в цитоплазме гладкомышечных клеток
1.3 Механизмы сокращения гладкой мышцы при повышении внутриклеточной концентрации Са2+
1.4 Повышение чувствительности сократительного аппарата к Са2+ - важный механизм сокращения гладкой мышцы
1.4.1 Механизмы Са2+-сенсптпзации, связанные с повышением степени фосфорилнрования РЛЦ миозина
1.4.2 Механизмы Са2+-сенситизации без изменения степени фосфорилирования РЛЦ миозина
1.4.3 Временные характеристики Са2+-зависимого и Са2+-независимого сокращения
1.5 Регуляция активности ФЛЦМ
1.5.1 Механизм действия ПКС
1.5.2 Механизм действия Ыю-киназы
1.5.3 Временные характеристики Са2+-сенситизации с участием протеинкиназы С и Шю-киназы
1.5.4 Относительный вклад ПКС и Шю-киназы в разных кровеносных сосудах
1.6 Возрастные изменения механизмов сокращения гладкой мышцы
1.6.1 Изменения на уровне регуляции Са2+-гомеостаза
1.6.1.1 Изменение мембранного потенциала
1.6.1.2 Изменение калиевых и кальциевых каналов
1.6.1.2.1 Калиевые каналы
1.6.1.2.2 Кальциевые каналы
1.6.2 Изменения на уровне регуляции чувствительности сократительного аппарата к Са2+
1.6.3 Изменения экспрессии/активности белков, регулирующих сокращение гладкой мышцы
1.6.3.1 Изменения вклада протеинкиназы С и Шю-киназы в регуляцию сокращения
1.7 Актуальность и логика построения данной работы
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Животные и объект исследования
2.2. Физиологические эксперименты
2.2.1 Растворы, использованные в физиологической части работы
2.2.2 Приготовление препарата. Измерение силы сокращения в изометрическом режиме
2.2.3 Нормализация растяжения препарата
2.2.4 Измерение концентрации Са2+ внутри клеток
2.2.5 Активация препарата
2.2.6 Общий протокол эксперимента
2.2.7 Обработка результатов
2.2.7.1 Нормирование силы сокращения
2.2.7.2 Нормирование Б340/Р380
2.2.8 Вычисление Са2+-чувствительности
2.2.9 Статистическая обработка результатов
2.2.10 Реакгивы, использованные в экспериментах на изолированных сосудах
2.3 Биохимические эксперименты
2.3.1 Получение образцов для биохимического анализа
2.3.2 Гомогенизация и экстрагирование образцов
2.3.3 Электрофорез
2.3.4. Иммуиоблоттинг
2.3.5 Обработка результатов
2.3.6 Статистическая обработка результатов
2.3.7 Реактивы, использованные в биохимической части работы
3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1 Результаты физиологических экспериментов
3.1.1 Эффекты МХ и ингибитора Ыю-киназы У27632 на силу сокращения, [Са2+], и Са2+-чувствительность. Серия экспериментов «КС15-МХ-У»
3.1.2 Воспроизводимость эффектов МХ на силу сокращения, [Са2+], и Са2+-чувсгвительность (контроль к серии «КС15-МХ-У»), Серия экспериментов «Кон-МХ-У»
3.1.3 Эффекты МХ и ингибитора протеинкиназы С СР109203Х на сил)' сокращения, |_Са2+ф и Са2+-чувствительность. Серия экспериментов «КС15-МХ-вР»
3.1.4 Воспроизводимость эффектов МХ на силу сокращения, [Са2’], [I Са2+-чувствительность для серии экспериментов «КС15-МХ-ОР». Серия экспериментов «Кон-МХ(ОР)»
3.1.5 Эффекты МХ и ингибитора Ь-типа Са2+ каналов нимодипина на силу сокращения, [Са2+], и Са2+-чувствительность. Серия экспериментов «КС15-МХ-№т»
3.1.6 Эффекты К+-деполяризации и ингибитора Шю-киназы У27632 на силу сокращения, [Са2+]; и Са2+-чувствительность. Серия экспериментов «КС15-КС142-У»
3.1.7 Воспроизводимость эффектов К+-деполяризации на силу сокращения, [Са2+]; и Са2’-чувствительность - контроль к серии экспериментов «КС15-КС142-У». Серия экспериментов «Кон-КС142(У)»
3.1.8 Эффекты К+-деполяризации и ингибитора протеинкиназы С СР109203Х на силу сокращения, [Са2+], и Са2+-чувствительность.Серия экспериментов «КС15-КС142-СР»
3.1.9 Воспроизводимость эффектов К+-деполяризации на силу сокращения, [Са2+]; и Са2+-чувствительность - контроль к серии экспериментов «КС15-КС142-СР». Серия экспериментов «Кон- КС142(СР)»
3.1.10 Изменения [Са2+]; и силы сокращения при разной степени К+-деполяризации (42 и 120 мМ КС1). Серия экспериментов «КС1120-КС142-КС15»

Таблица 1. Состав растворов, использованных в физиологических
экспериментах. Приведены концентрации веществ в мМ.
Вещества Раствор для препаровки Рабочий раствор (К+5 мМ) Рабочий раствор без Са“+ (К+ 5 мМ) Рабочий раствор без С а (К+ 42 мМ) Рабочий раствор без Са2+ (К+ 120 мМ)
ИаС1 145 120 120 82,95
ИаНСОз - 26 26 26
КС1 4,5 4,5 4,5 41,6 118
СаС12*2Н20 0,1 1,6 - - -
М§804*7Н20 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
ИаН2Р04*2Н20 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2
О-глюкоза - 5,5 5,5 5,5 5
ЕША 0,025 0,025 0,025 0,025 0,025
НЕРЕв 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0
Подкожную артерию отсепаровывали от окружающих тканей и из ее средней части вырезали сегмент длиной 2 мм (рис 2). Полученный таким образом кольцевой препарат сосуда надевали на две струны из нержавеющей стали диаметром 40 мкм и с их помощью закрепляли препарат между головками миографа. Одна из головок была соединена с тензометрическим датчиком для измерения силы сокращения, а другая - с микрометром, с помощью которого устанавливалось расстояние между струнами и, таким образом, растяжение препарата (рис. 3).
Головки миографа, между которыми располагали препарат находились в камере объемом 5 мл постоянно аэрируемой карбогеном (95% 02 + 5% С02) для поддержания pH = 7,3 - 7,4. Для удаления раствора из камеры миографа использовали вакуумный насос. Изначально камера была заполнена холодным физиологическим раствором без Са2+ с 5 мМ К+. После закрепления препарата, миограф подключали к рабочей установке и проводили постепенный нагрев раствора до температуры 37°С. На протяжении нагрева струны оставались сведены на минимальное расстояние, но не касались друг друга. После достижения температуры в 37°С в камеру добавляли ОЕА-ЫО (1мкМ) для