Влияние глюкокортикоидов и гипоксии на ключевые белки апоптоза и их регуляторы в мозге неонатальных крыс

• Автор: Музыка, Владимир Владимирович
• Шифр специальности: 03.03.01
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 131 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ
Введение
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Влияние глюкокортикоидов и гипоксии на экспрессию ключевых белков каскада апоптоза и их регуляторов в развивающемся головном мозге
1.1. Программируемая гибель клеток - апоптоз, и его молекулярные механизмы
1.1.1. Каспазы
1.1.2. Белки Вс1-2 семейства
1.1.3. Пути запуска апоптоза
1.2. Нейротрофины - регуляторы жизнеспособности и гибели нервных клеток
1.2.1. Экспрессия нейротрофинов и их рецепторов
1.2.2. Молекулярные механизмы действия нейротрофинов
1.2.3. Нейротрофины и апоптоз в онтогенезе ЦНС
1.3. Роль глюкокортикоидов в регуляции апоптоза в развивающейся НС
1.3.1. Рецеторы глюкокортикоидов 3
1.3.2. Механизмы действия глюкокортикоидов
1.3.3. Эффекты глюкокортикоидов в ЦНС
1.3.3.1. Влияние глюкокортикоидов на процессы апоптоза
1.4. Эффекты гипоксии на процессы апоптоза в развивающейся нервной системе
1.4.1. Молекулярные механизмы влияния гипоксии
1.4.2. Совместное влияние гипоксии и глюкокортикоидов на апоптоз в ЦНС 46 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Животные и экспериментальные воздействия
2.1.1. Животные
2.1.2. Введение гормонов
2.1.3. Моделирование гипоксического состояния
2.2. Выделение образцов ткани мозга
2.3. Выделение РНК
2.4. Получение кДНК

2.5. Оценка уровней мРНК белка Bcl-XL методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (real-time PCR)
2.6. Выделение суммарного белка и его разделение посредством одномерного денатурирующего гель-электрофореза
2.7. Оценка уровней mat-BDNF, pro-BDNF, Bcl-XL, Вах, прокаспазы-3, активной каспазы-3 и GR методом полуколичественного иммуноблота
2.8. Реактивы
2.9. Статистическая обработка данных
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Анализ взаимного сопряжения экспрессии белков апоптоза в гиппокампе и стволе головного мозга 3-дневных крысят
3.2. Экспрессия форм BDNF в отделах мозга неонатальных крысят
3.2.А. 3-дневные животные
3.2.Б. 8-дневные животные
3.3. Влияние глюкокортикоидов на уровни форм BDNF и ключевых белков апоптозного каскада — Bcl-XL, Вах, прокаспазы-3 и активной каспазы-3 - в отделах мозга неонатальных крысят
3.3.А. 3-дневные животные
3.3.Б. 8-дневные животные
3.3.В. Анализ эффектов дексаметазона на уровень активной каспазы-3 в мозге через 6,24 и 120 ч после введения гормона
3.4. Эффекты гипоксии и дексаметазона на экспрессию GR в неонатальном мозге
3.5. Влияние гипоксии и дексаметазона на экспрессию ключевых белков апоптозного каскада в отдех мозга неонатальных крысят
3.5.А. Эффекты гипоксии
3.5.Б. Эффекты дексаметазона на фоне предшествующей и последующей гипоксии
ГЛАВА 4, ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ВЫВОДЫ
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ
AIF - apoptosis inducing factor - фактор индукции апоптоза АР-1 - activator protein-1 - белок-активатор-
BAD - Bcl-2-associated agonist of cell death - Вс1-2-ассоциированный агонист гибели клеток
Bax - Bcl-2-associated x protein — Вс1-2-ассоциированный x белок
Bcl-2 - В-cell lymphoma protein-2 — белок В-клеточной лимфомы-
Bcl-XL - Bcl-2 X-linked protein — Bcl-2 Х-связанный белок
BDNF - brain-derived neurotrophic factor - мозговой нейротрофический фактор
BH домен - домен Вс1-2 гомологии
CAD - caspase-activated DNAse - каспазо-активируемая ДНКгидролаза
CaRF - Calcium-responsive transcription factor - кальций-зависимый транскрипционный фактор CREB - cAMP-responsive element binding protein - цАМФ-зависимый транскрипционный фактор DISC - Death-inducing signaling complex - сигнальный комплекс, индуцирующий гибель клеток Est-2 - Expression sequence tag-1/2 - фрагмент, необходимый для экспрессии последовательности-1/2 ERK - Extracellular signal-regulated kinase - киназа, регулируемая внеклеточным сигналом HRE - hypoxia-responsive element - гипоксия-отвечающий элемент генома 11-p-HSD - 11-p-hydroxi steroid dehydrogenase - 1 l-p-гидроксистероид дегидрогеназа HSP - heat-shock protein - белки теплового шока GR - глюкокортикоидный рецептор
GRE - glucocorticoid-responsive element - гормон-отвечающий элемент генома IAP - inhibitor of apoptosis protein - белок ингибитор апоптоза JNK - Jun N-terminal kinase - Jun N-концевая киназа
МАРК - mitogen-activated protein kinase - митоген-активируемая протеин киназа
mat-BDNF - mature BDNF - зрелая форма мозгового нейротрофического фактора
МЕК - МАРК/ЕRK kinase - MAPK/ERK киназа
MR - минералокортикоидный рецептор
NGF - nerve growth factor - фактор роста нервов
NF-кр - nuclear factor-кр - ядерный фактор-кр
NRIF - neurotrophin receptor interacting factor - фактор, взаимодействующий с рецептором нейротрофинов
p75NTR - р75-нейротрофиновый рецептор PI3K - фосфатидил-инозитол-3 киназа PLC - фосфолипаза С
RIP - regulated intermembrane proteolysis - регулируемый внутримембранный протеолиз
ROS - reactive oxygen species - активные формы кислорода
ТМ домен - трансмембранный домен
TNF - tumor necrosis factor — фактор некроза опухолей
TrkB - tropomyosin-related kinase В - киназа В, родственная тропомиозину
USF-1/2 - upstream stimulatory factor-1/2 - вышележащий фактор стимуляции 1/
VDАС - voltage-dependent anion channel - потенциал-зависимый анионный канал
VEGF - vascular endothelial growth factor - фактор роста эндотелия сосудов
АКТГ - адренокортикотропный гормон
ГАМК- гамма-амино-масляная кислота
ГГНС - гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковая система
ПКГ - программируемая клеточная гибель
РДС - респираторный дистресс-синдром

действует как доминантный негативный транскрипционный фактор (van der Laan and Meijer, 2008).
У человека экспрессия гена MR контролируется двумя промоторами (PI, Р2), а у крыс как минимум тремя (MR-alpha, MR-beta, MR-gamma), с которых считываются альтернативные транскрипты (Vazquez, Lopez et al. 1998). Наблюдаются вариации в экспрессии и регуляции разных транскриптов MR в ходе развития и во взрослом возрасте (Vazquez, Lopez et al. 1998; Rogalska, Kang et al. 2009).
Минерало- и глюкокортикоидные рецепторы имеют различные трансляционные варианты, как следствие множественных функциональных последовательностей Козака в их мРНК. Эти варианты, называемые например минералокортикоидными рецепторами А, В и т.д., отличаются по своему влиянию на транскрипцию других генов. Интересно, что эти трансляционные варианты таюке экспрессируются тканеспецифичным образом (Pascual-Le Tallec and Lombes, 2005).
Несмотря на свою схожесть, MR и GR зачастую по-разному влияют на различные процессы в ЦНС. Эффекты глюкокортикоидов, осуществляемые через MR, как правило, увеличивают возбудимость и стабильность функционирования нейронных сетей, а активация GR приводит к отложенной супрессии некоторых процессов, запущенных через MR (de Kloet, Fitzsimons et al. 2009). Указанные особенности, во многом, определяются различиями в способности GR и MR к привлечению разнообразных корегуляторов транскрипции, что приводит к различиям в эффектах двух типов рецепторов на экспрессию генов (de Kloet et al., 2005). Существуют региональные особенности эффектов глюкокортикоидов на функционирование нервных клеток, связанные с различиями в уровнях экспрессии двух типов рецепторов в разных отделах мозга, и, следовательно, различной величиной отношения экспресии GR/MR в них. В целом, GR экспрессируются в большинстве тканей плода, начиная с ранних эмбриональных этапов (Speirs et al., 2004), их экспрессия высока в плаценте (Meaney, Szyf et al. 2007).
В мозге GR экспрессируются повсеместно как в нейронах, так и в глиальных клетках (de Kloet et al., 2005). Плотность GR наиболее велика в мелкоклеточных паравентрикулярных ядрах гипоталамуса, в нейронах восходящих аминоэргических